章晓芳 丁金旺 詹宇红 马丽珍

甲状腺微小乳头状癌和直径＜1cm的甲状腺良性结节在术前主要依靠B超以及甲状腺细针穿刺鉴别。由于甲状腺乳头状癌（PTC）B超的影像学表现缺乏特异性，而细针穿刺由于结节较小、得到的细胞数量较少难以确诊PTC。循环miRNA存在于外周血中，大规模的临床研究表明检测患者循环miRNA可以鉴别多种良恶性肿瘤[1]，因此有望成为肿瘤早期诊断的分子标志物。本研究通过miRNA测序法筛选出甲状腺微小乳头状癌与甲状腺良性结节患者外周血中差异表达的miRNA，并对其生物信息学内容进行分析，为进一步探讨miRNA在甲状腺微小乳头状癌早期诊断中的作用提供帮助。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2017年3至7月我院肿瘤外科收治的甲状腺结节患者，经术后病理诊断为甲状腺微小乳头状癌和甲状腺良性结节（直径＜1cm）各5例，两组均为男2例，女3例，平均年龄分别为42岁和49岁。本研究经我院伦理委员会批准以及所有标本的获取均经患者同意并签署知情同意书。

1.2 标本收集 两组患者入院时即抽取外周静脉血5ml于EDTA抗凝管中，混匀后即置于4℃或冰盒中保存，并于1h内进行血浆分离；1 500r/min离心10min后得到上层血浆；将血浆转移至1.5ml无RNA酶（RNase free）中，每个管子吸入200μl血浆进行分离，弃去沉淀的血细胞；将分装好的血浆置于-80℃保存。

1.3 血浆总RNA提取及质量检测 使用TRIzol LS Reagent分离提取总RNA，使用NanoDrop ND-1000测定RNA浓度和纯度。本研究RNA提取以及质量检测、测序、数据分析均委托上海康成生物进行，10例样本RNA浓度和纯度均达到后续试验的标准。

1.4 miRNA测序 按照Illumina NextSeq 500仪器说明书中的步骤进行测序。首先使用每个样品的总RNA制备miRNA测序文库，然后将文库变性为单链DNA分析，在illumina flow cell上进行捕获，原料扩增为簇，在测序仪上进行50个cycle测序。

1.5 数据分析 测序完成后，使用Solexa CHASTITY质控筛选原始Reads得到Clean Reads。将Clean Reads去接头，并留下长度≥15nt的tag得到trimmed Reads。然后，使用 Novoalign 软件（v2.07.11）将 trimmed Reads比对到合并的pre-miRNAs数据库上（miRBase v21 pre-miRNAs），最多允许1处错配。在计算miRNA表达的时候，数量＜2的Reads被舍弃。为了表征异构体的变化，成熟体区域±4nt的Reads被当作成熟miRNA的异构体，并且根据在前体发卡的位置分为5P类和3P类。统计比对到每条成熟miRNA区域（±4nt）上的Reads数作为该miRNA的原始表达量，并使用TPM（tag counts per million miRNA alignments）对样品进行标准化。基于标准化的所有miRNA异构体的tag数，对实验计算两组样品（有重复）间的P值和倍数变化，并根据P值和倍数变化筛选差异miRNAs。计算两个样品（没有重复）间的倍数变化，并根据倍数变化筛选差异miRNAs。

1.6 聚类图和靶基因预测以及生物信息学分析 采用mirdbV5和TaregetScan7.1对差异表达miRNA进行靶基因预测，并运用Gene Ontology（GO）分析和KEGG信号通路数据库富集靶基因以初步分析其功能。GeneR-atio是该GO Term相关的基因数与整个差异基因总数的比值。该值越大代表该GO Term的意义越大。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件。计量资料以表示，两组间比较采用 t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者差异表达的miRNA miRNA测序时选取增加倍数为1.3倍，降低倍数为0.77倍，将P≤0.05的miRNA作为差异表达的miRNA。结果显示甲状腺微小乳头状癌较甲状腺良性结节表达量增加的miRNA 3个，减少的miRNA 8个，见表1、2。将这些差异miRNA进行聚类分析如图1所示（见插页）。

图1 甲状腺微小乳头状癌和甲状腺良性结节差异miRNA聚类图（PTMC：甲状腺微小乳头状癌；BN：甲状腺良性结节）

表1 甲状腺微小乳头状癌较甲状腺良性结节表达量增加的miRNA

表2 甲状腺微小乳头状癌较甲状腺良性结节表达量减少的miRNA

2.2 靶基因预测 通过 mirdbV5和 TaregetScan7.1对差异表达miRNA进行靶基因预测。上调的3个差异miRNA通过mirdbV5预测共有201个靶基因，通过TaregetScan7.1预测共有412个靶基因，两者交集靶基因为76个。下调的8个差异miRNA通过mirdbV5预测共有1 145个靶基因，通过TaregetScan7.1预测共有1 057个靶基因，两者交集靶基因为298个。选取两个软件共同预测到的靶基因进一步进行GO和KEGG分析。

2.3 GO分析靶基因的生物学功能预测结果 GO分析共有3种分析方法，生物学过程（biology process，BP），细胞组分（cell compontent，CC）和分子功能（molecular function，MF）。本研究主要进行BP分析。图2（见插页）显示的是上调miRNA预测到的差异基因进行GO分析得到的前10个GO Term，提示蛋白质修饰和细胞分解代谢可能与甲状腺微小乳头状癌发生相关。下调的miRNA预测到差异基因进行GO分析提示代谢过程和生物合成过程可能与甲状腺微小乳头状癌相关（图3，见插页）。

图2 上调miRNA靶基因参与的GeneRatio前10 GO term[GeneRatio：GO Term相关的基因数（Count）与整个差异基因总数（List Total）的比值]

图3 下调miRNA靶基因参与的GeneRatio前10 GO term[GeneRatio：GO Term相关的基因数（Count）与整个差异基因总数（List Total）的比值]

2.4 差异miRNA靶基因KEGG信号通路预测结果 由于上调miRNA数量较少，KEGG数据库分析结果提示只有一条信号通路即RNA降解与甲状腺微小乳头状癌相关，参与的基因为PAPD5和TOB1，相关miRNA分别为hsa-miR-532-3p和hsa-miR-636。下调miRNA靶基因通过KEGG分析提示内质网中的蛋白质加工以及HIF-1信号通路可能参与PTMC发生。下调miRNA靶基因参与的GeneRatio前10的信号通路图4（见插页）。

图4 下调miRNA靶基因参与的GeneRatio前10 Pathway term[GeneRaio:Pathway Term相关的基因数（selection Count）与差异基因总数(selection size)的比值]

3 讨论

随着颈部超声检查的广泛应用，甲状腺结节在普通人群中的发病率非常普遍，呈逐年上升的趋势[2]。大部分的甲状腺结节为良性结节，只有5%～10%的结节为恶性，且恶性结节中90%是甲状腺乳头状癌[3]。甲状腺乳头状癌采取手术治疗，而良性甲状腺结节采取定期随访的原则[4]。目前甲状腺结节术前良恶性的判断主要依靠高频超声，但是目前没有非常特异的B超影像特征可以诊断PTC[5]。在有条件的医院开展了B超引导下甲状腺细针穿刺，该项技术目前是甲状腺结节术前诊断的金标准[6]，具有较高的灵敏度和特异度[7]。由于细针穿刺技术常受限于甲状腺结节的大小，穿刺抽取细胞数以及血液的污染，以及患者的接受程度，导致细胞学诊断仍不能确诊PTC。因此非常有必要发现一种无创的，且灵敏度和特异度较高的、操作简单的方法早期诊断PTC，为临床医生定制治疗方案提供可靠依据。

miRNA是一种小的、非蛋白质编码RNA，通过在转录后水平抑制目的mRNA的表达而发挥调节作用[8]。miRNA参与细胞的增值、分化、凋亡、黏附和肿瘤细胞的整个发生过程。miRNA在人类多种肿瘤细胞中表达失调，包括甲状腺肿瘤[9-10]。大量的研究表明在甲状腺乳头状癌患者和正常人之间存在差异表达的miRNA。尽管这些数据表明miRNA可能是一个鉴别良恶性肿瘤的重要指标，但是缺陷在于只能在术后手术切除标本中进行检测，不能作为一个早期诊断标记用于指导临床。

循环中的miRNA存在于血液中，对RNA酶耐受，因此非常容易检测，操作简便且可靠性较高。目前关于miRNA的来源不是非常明确，可能来由肿瘤细胞释放而来，也可能为免疫细胞释放，凋亡或者坏死的肿瘤细胞释放等多种途径而来。大规模的临床研究证明在多种肿瘤包括甲状腺肿瘤中循环miRNA可以鉴别良恶性肿瘤，有望成为肿瘤早期诊断的分子标志[10]。

目前关于血清miRNA在甲状腺肿瘤中的研究目前有4篇影响力较大的报道，2012年我国学者首次通过Solexa sequencing方法发现 let-7e、miRNA-151-5P和miRNA-222在PTC中较良性甲状腺结节和正常人均增高，且与PTC的TNM分期和肿瘤大小有关[11]。2014年意大利学者报道了白种人PTC血清miRNA-95和miRNA190均较正常人和甲状腺结节增高，但该研究未发现差异miRNA与PTC临床特征如肿瘤大小，TNM分期有相关性[12]。2017年该团队扩大样本量，在1 000例患者中进一步验证了这两个miRNA在甲状腺乳头状癌早期诊断中的意义，研究发现miRNA-190 and-95联合甲状腺细针穿刺技术可以明显提高术前甲状腺乳头癌的诊断（灵敏度为96.3%）[13]。而在2015年我国学者发现PTC血清中miR-25-3P和miR-451a较正常人和良性甲状腺结节患者含量增高，但该研究未分析差异的miRNA与PTC临床特征的相关性[14]。2016年来自中国学者发现 miR-124-3p、miR-9-3p、miR-4701和 miR-196b-5p在甲状腺乳头状癌和甲状腺良性结节外周血中具有明显差异[15]。

鉴于以上结果的不一致性，本研究采用Illumina NextSeq 500测序仪进行miRNA测序分析，结果提示甲状腺微小乳头状和甲状腺良性结节miRNA表达存在明显差异，11个差异表达的miRNA与其他研究结果不一致，这可能与选取的样本有关，本研究选取甲状腺微小乳头状癌以及直径＜1cm的良性结节，而其他研究大多选取甲状腺乳头状癌，没有规定大小。miRNA-181与黑色素瘤、急性白血病、非小细胞肺癌均有关[16-18]。本研究首次发现甲状腺微小乳头状癌miRNA较甲状腺良性结节表达减少，提示miRNA-181可能参与甲状腺微小乳头状癌的发生，为术前进一步明确诊断甲状腺微小乳头状癌提供实验室依据。miR-30a在甲状腺乳头状癌中表达减少，通过促进IGF-1R促进甲状腺乳头状癌的增值，迁移以及上皮细胞间质变[19]。本研究在PTMC血浆中检测到miR-30a的含量较低，提示血浆miR-30a可能为鉴别良恶性的指标之一。miRNA-139通过增强fibronectin 1表达促进甲状腺乳头状癌的增值和侵袭[20]，与本研究结果相似，这提示血浆miRNA-139可能为甲状腺结节良恶性鉴别指标之一。尽管经过文献查阅提示miR-181、miR-30a、miR-139在甲状腺乳头状癌中表达量减少，与本研究相似，但这3种miRNA能否进一步作为甲状腺乳头状癌术前诊断的指标之一，仍需我们扩大样本进一步证实。

通过KEGG分析差异miRNA靶基因的信号通路，提示HIF-1信号通路可能参与甲状腺微小乳头状癌的发生，这与文献报道的结果相似，HIF-1与甲状腺乳头状癌的淋巴结转移，包膜转移以及TNM分期相关[21-22]。

甲状腺微小乳头状癌和甲状腺良性结节miRNA表达谱存在明显差异，血浆miR-181、miR-30a、miR-139能否作为术前鉴别甲状腺良恶性结节的指标，还需要进一步扩大样本进行验证。尽管样本数比较少，仍为进一步探讨miRNA在微小乳头状癌的早期诊断提供理论依据和思路。