袁蕊，王学江，李峰

(五洲丰农业科技有限公司，山东 烟台 264000)

海藻肥是以天然海藻为原料，通过物理和生化工艺提取、精制或再混配以氮磷钾和微量元素制成的生物肥，含有海藻特有的海藻酸钠、海藻多糖、酚类聚合物、不饱和脂肪酸、植物自然生长调节物质等。海藻酸钠又称褐藻酸钠或海藻胶，是从海带、马尾藻、巨藻等褐藻细胞壁中提取的多糖化合物，主要由α-L-甘露糖醛酸(M单元)和β-D-古罗糖醛酸(G单元)2种单体聚合而成的线性高分子多糖，分子式为(C6H7O6Na)n，结构单元分子量理论值为198.11[1-3]。大量研究表明，海藻酸钠可以降低水的表面张力，使作物有效吸收海藻肥中的有效成分，增加土壤团粒结构，破除板结。海藻酸钠常被用于评价海藻肥质量，行业内出台的海藻酸包膜尿素、海藻酸复合肥料、海藻酸水溶肥料标准都对该指标含量做了明确要求，但并未对分子量作规定，目前对海藻酸钠分子量的检测尚无统一方法，因此，对检测方法的探讨具有重要的现实意义。

海藻酸钠的分子量是决定其流变性能、成膜性能、溶解性能等[4-5]性能的重要因素，常用测定海藻酸钠分子量的方法是乌氏粘度法，通过测量其特性粘度值计算出其粘均分子量，此法的缺点是不能直接求出绝对平均分子量，而是通过经验公式计算，因此精确度较差[6-8]。高效液相色谱(HPLC)法是检测高聚物分子量的常用方法之一，具有快速、高分辨率和重现性好的优点[9-13]。本研究采用HPLC法对海藻酸钠分子量测定方法进行研究，并测定海藻肥中海藻酸钠分子量大小，为海藻酸钠分子量的测定提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

T5、T10、T40、T70、T150、T500、T1000系列葡聚糖标准品，上海源叶生物科技有限公司；生物海藻液肥，五洲丰农业科技有限公司；DEAE-52离子交换柱、G200凝胶层析柱，美国sigma-aldrih公司；无水乙醇、碳酸钠、氯化钙、苯酚、硫酸等试剂均为分析纯。

高效液相色谱仪，美国珀金埃尔默公司；离心机、层析柱、紫外可见分光光度计，日本岛津公司；自动部分收集器，上海沪西分析仪器厂；恒流泵，上海沪西分析仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 海藻酸钠纯化

将生物海藻液调pH值7左右，加入一定量10%氯化钙溶液，析出海藻酸钙凝胶，用碳酸钠溶液溶解凝胶，充分搅匀，中和至pH值7～8，使凝胶脱钙转变成海藻酸钠，离心除杂收集上清液，加入10%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，静置过夜后12 000 r·min-1离心30 min，得到上清液和沉淀，沉淀中加入10%氯化钠溶液，以离解沉淀复合物，离心后将上清液装入截留分子量为3 000的透析袋中，磁力搅拌下用超纯水透析24 h，每4 h换1次水，最后加入无水乙醇析出海藻酸钠，多次洗涤并干燥，即得粗品海藻酸钠[14-17]。

1.2.2 海藻酸钠紫外光谱分析

配制一定浓度的海藻酸钠粗品溶液，选择波段190～400 nm，在紫外可见分光光度计中进行扫描。

1.2.3 海藻酸钠的精纯

将海藻酸钠配成溶液，上DEAE-52离子交换柱(26 mm×200 mm)，然后用0.1 mol·L-1氯化钠溶液进行洗脱，流速调节为1.0 mL·min-1，收集洗脱馏分，每管10 mL，收集液用苯酚-硫酸显色法跟踪检测多糖，在波长为490 nm处测定吸光度，绘制洗脱曲线，同一吸收峰内的洗脱液合并，透析除盐后浓缩备用。

1.2.4 海藻酸钠纯度鉴定

经纤维素处理的海藻酸钠溶液上葡聚糖G200凝胶层析柱(20 mm×300 mm)，去离子水洗脱，流速为1.0 mL·min-1，每5 mL收集1管，苯酚-硫酸显色法测定490 nm处吸光度，绘制洗脱曲线，同一吸收峰内的洗脱液合并，蒸发浓缩后干燥。

1.2.5 HPLC检测

色谱柱为PSS suprema linear M色谱柱，色谱柱检测器为示差检测器，流动相为超纯水，流速0.5 mL·min-1，柱温45 ℃，进样体积20 μL[18-20]。将葡聚糖标准品配制成终浓度为1 g·L-1溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析，以峰位保留时间(t)为横坐标，相对分子量的对数值(lgMw)为纵坐标做标准曲线，得回归方程。海藻酸钠样品配制成1 g·L-1溶液，进行HPLC分析，记录峰位保留时间。根据待测样品出峰时间及标准曲线，计算样品分子量。

2 结果与分析

2.1 海藻酸钠的分离纯化

海藻酸钠粗品溶液经紫外光谱分析(图1)，在260 nm和280 nm处无特征吸收峰，说明海藻酸钠粗品不含核酸和蛋白质。

图1 海藻酸钠的紫外光谱

海藻酸钠粗品溶液经DEAE-52纤维素离子交换柱层析洗脱，G200凝胶层析柱分离并经紫外光谱分析，呈现单一对称峰，初步判断其为单一组分。

图2 海藻酸钠葡聚糖凝胶柱洗脱的曲线

2.2 分子量标准曲线的绘制

葡聚糖系列标准样色谱图均只出现1个吸收峰，峰宽较窄且峰形较好。以葡聚糖标准品的分子量对数(lgMw)对保留时间(t)进行回归处理，得线性回归方程为：lgMw=-0.607t+13.07，R2=0.992，回归关系较好。

2.3 海藻酸钠分子量的测定

分离纯化的海藻酸钠经HPLC检测，有1个单一样品峰，不含其他杂峰，峰型对称，峰型较好，说明海藻酸钠纯化样品为均一性组分，出峰时间为10.258 min，根据回归方程计算得出，海藻液中褐藻酸钠分子量在6 972 587附近分布。

3 讨论

采用钙析、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)络合法，对海藻液进行初步纯化，得海藻酸钠粗品，粗品经DEAE离子交换柱层析得到纯化海藻酸钠，经葡聚糖凝胶柱色谱和高效凝胶液相色谱鉴定为单一组分，测得分子量在6 972 587附近分布。本研究采用的高效液相色谱法与粘度法相比，具有高效、快速、灵敏度高的优点，所需样品少，可用于低含量样品检测，避免乌氏粘度法通过经验公式计算所带来的误差。

目前市场上海藻肥种类繁多，有效物质质量评价也集中在海藻酸钠的含量的测定。海藻酸钠作为一种高分子聚合物，不同分子量具有不同生理活性。研究表明，海藻酸钠的生理活性随其分子量的变化而不同，分子大小对于其生物活性的发挥至关重要，2～10个单糖分子聚合而成的聚合物为褐藻寡糖，褐藻寡糖能够促进植物生长发育，增强植物对外界环境的适应能力，具有提高作物产量及品质，提高多种酶的活性，清除自由基，遏制机体氧化等功能。周旭霞等[21]研究发现，酶解海藻酸钠得到的褐藻胶寡糖具有较强的抗氧化活性，分子量越小的寡糖抗氧化性越强。张明杰等[22]发现，酶解制备的褐藻寡糖可有效清除DPPH和羟自由基，分子质量最小的组分其清除羟自由基的能力与VC相近。胡博旸等[23]采用酸解海藻酸钠得到不同分子量的海藻酸钠组分，制备的褐藻寡糖具有较强的抗氧化能力，且抗氧化效果与寡糖的平均聚合度含量有关。李佳琪等[24]应用4种不同分子量的褐藻寡糖喷施在黄瓜幼苗叶片，经寡糖处理过的幼苗株高、茎粗、株幅和鲜重均有显著增加，且不同分子量的褐藻寡糖对黄瓜生长的促进效果存在差异。由此可见，分子量大小与海藻酸钠生理活性密切相关。本研究为海藻肥中褐藻酸钠分子量测定建立了检测方法，既可以进行分离，也可以进行定量分析，为小分子海藻酸钠分子量的测定工作提供了实践依据，对其结构解析、功能研究及构效关系的探索具有重要意义。

图3 海藻酸钠的色谱