刘涵玉，何腊平，2，*，李翠芹，陈翠翠，郑佳，朱秋劲，2，陶菡，2

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学化学与化工学院，贵州 贵阳 550025）

牛干巴属于干腌牛肉这一大类产品，是我国云贵川特色腊牛肉制品，具有风味独特、味道鲜美、食而不腻等特点[1]。风味决定了消费者对产品的可接受程度。不同地区的牛干巴因其加工工艺、制作原料、气候等因素的不同，形成了不同的风味特征。已有学者对云南、新疆等地的牛干巴挥发性风味成分进行研究[2-3]。沙坤等[2]指出云南黄牛和牦牛干巴分别由50 种和42种挥发性风味成分，并且确定了新疆不同地区的风干牛肉样品特征性香气成分：己烷、2-戊基-呋喃、1-辛烯-3-醇和部分醛类。Kaban 等[4]报道了土耳其干腌牛肉中检测出48 种挥发性风味成分，芳樟烃类是含量最丰富的化合物。但针对贵州牛干巴研究还未见报道。因此有必要对贵州牛干巴挥发性风味成分进行研究。

目前对牛干巴菌群结构的研究还是最传统的分离方法，由于传统培养方法的局限性，使其不能全面真实反应牛干巴中微生物的群落组成。因此有必要采用当前较先进成熟，价格适当的illumina MiSeq 第二代高通量测序平台。

本试验以贵州市售牛干巴为材料，采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用仪对其挥发性成分进行分析并结合主成分分析，找到贵州牛干巴的风味成分的组成，同时结合illumina MiSeq 第二代高通量测序平台，评估牛干巴中细菌群落结构和多样性；在此基础上进一步分析牛干巴中风味品质与细菌群落多样性之间的关系，为牛干巴产品的风味品质评价，加深对牛干巴发酵机制的认识，以及生产工艺的优化提供科学依据。

1 方法与材料

1.1 材料与试剂

试验所用3 组贵州干巴（真空包装）购于贵州兴义农贸市场，样品编号分别为：牛干巴1、2、3 号。样品购买后切分成小块，真空包装，并储存于于-80 ℃冷冻冰箱中备用。

正构烷烃（色谱纯）：北京百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A-7000B 气-质联用仪：美国安捷伦科技有限公司；DB-WAX 型色谱柱（250 μm × 0.25 μm，30 m）：美国 J＆W Scientific 公司；固相微萃取装置（50/30 μm CAR/DVB/PDMS 固相微萃取头）：美国Supelco 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 感官评定

感官评定参照高月娥等[5]的方法。由10 位专家组成的评价小组分别从色泽、口感、气味、滋味和组织状态5 个方面对牛干巴进行感官分析。

1.3.2 挥发性风味成分的测定

顶空固相微萃取条件：称取3 g 肉样切碎成肉末，放入20 mL 萃取瓶，密封，50℃条件下平衡20 min。插入50/30 μm CAR/DVB/PDMS 固相微萃取头进行吸附40 min。转移插入气相色谱质谱仪（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）进样口，在 250 ℃温度下解析7 min，同时启动仪器采集数。

气谱条件：毛细管柱为DB-WAX 柱（250 μm×0.25 μm，30 m），程序升温：起始温度 40 ℃，保持 3 min；然后5 ℃/min 的速度升温到150 ℃，保持1 min；再以3 ℃/min 的速度升温到200 ℃，保持1 min；最后以5 ℃/min 的速度升温到230 ℃，保持3 min。气化室温度250 ℃；载气为 N2，流速 6 mL/min，分流比 5 ∶1。

质谱条件：电子电离源，电子能量70 eV，接口温度250 ℃，离子源温度为230 ℃，四极杆温度150 ℃，传输线温度280 ℃。

定性定量分析：对总离子流图中的各峰采用Nist2005 和Wiley275 普库检索，取匹配度70 %以上，初步确定牛干巴的挥发性成分，再结合标准系列烷烃（C7～C40）在相同气质条件下，根据保留时间，分别计算不同物质的保留指数（retention indices，RI），再结合网站www.odour.org.uk 上的RI 值进行化合物的鉴定。计算公式如下：

式中：TR（x）为待测组分保留时间，min；TR（z+1）为碳数为Z、Z+1 正构烷的保留时间，min；且TR（z）

定量分析：采用峰面积归一化法确定各化学成分的相对含量。

主成分分析：对3 种牛干巴样品相对含量大于0.05 的挥发性成分借助SPSS 20.0 进行主成分析。

1.3.3 高通量测序

3 种牛干巴样品送北京百迈克生物科技有限公司，提取DNA 后，进行扩增细菌16S V3-V4 区并对其产物进行处理形成测序文库，质检合格后，可用Illumina HiSeq 2500 进行测序。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0 软件对相关数据进行方差分析（Duncan 法）。

2 结果与分析

2.1 感官评价

贵州牛干巴感官评价结果见表1。

表1 贵州牛干巴感官评价得分Table 1 Sensory evaluation score of Guizhou Niuganba

1 号和3 号牛干巴色泽最好，切面呈玫瑰红，有光泽，感官评分显著高于 2 号牛干巴（P＜0.05），2 号牛干巴切面脂肪偏黄，色泽深暗，并且口感方面较为绵软，咀嚼缺乏韧劲，因此口感感官评分也较低。但是2 号牛干巴气味、滋味和组织形态得分均高于1 号和3 号牛干巴（P＜0.05），拥有牛干巴专有香气，气味浓郁，香味纯正，整体风味比例恰当，切面均匀光滑，组织纹理清晰。而1 号和2 号牛干巴中辛香料味道过重，掩盖了原本牛干巴的特有香气，整体风味不协调。

2.2 贵州牛干巴挥发性风味物质研究

贵州牛干巴挥发性风味成分的定性和定量分析结果见表2。

表2 贵州牛干巴挥发性风味成分的定性和定量分析Table 2 Qualitative and quantitative analyses of volatile compounds detected in Guizhou Niuganba

续表2 贵州牛干巴挥发性风味成分的定性和定量分析Continue table 2 Qualitative and quantitative analyses of volatile compounds detected in Guizhou Niuganba

续表2 贵州牛干巴挥发性风味成分的定性和定量分析Continue table 2 Qualitative and quantitative analyses of volatile compounds detected in Guizhou Niuganba

烃类是3 组牛干巴中检测种类最多的化学类别，共有 25 种，1 号牛干巴有 17 种（7.62%），2 号牛干巴11 种（50.8%），3 号牛干巴（12.62%）。烯烃类化合物种类相对较多，原因可能与加入的辛香料有关。这类烯烃气味强烈，阈值较低[6]，对贵州牛干巴的风味有重要贡献。如α-姜黄烯则存在于干姜等植物中[7]气味浓郁芳香。辛香料物质香气柔和，风味醇香，可同其他挥发性成分一起赋予牛干巴清香独特的风味[8]。可见辛香料添加的种类和含量对贵州牛干巴挥发性风味成分有比较大的影响。

本试验共鉴定出14 种醛类化合物，它是牛肉主要挥发性风味物质。1 号牛干巴含有12 种醛类（3.7%），3号牛干巴含有6 种2.46%），2 号牛干巴含有4 种，虽然数量最少，但是含量都高于另外两组。醛类主要来自于脂肪氧化和斯特雷克尔（strecker）氨基酸反应[9]。这些醛类当中，直链脂肪醛、烯醛是典型的脂肪氧化的产物[10]，检测到的戊醛、己醛、（E）-2-庚烯醛可能源于不饱和脂肪酸的氧化作用[11]。而氨基酸的strecker 降解可以形成支链醛，如苯甲醛、苯乙醛等[12-13]。醛类由于香气阈值一般较低，且具有薄荷味[14]、清香和油脂香气味特征，对干腌肉制品的风味形成有重要贡献，是肉类风味品质的重要评价标准之一[15]，常被认为对不同种肉的特征香气有贡献[16-17]。

醇类一般来源于微生物代谢（苯乙醇等支链醇）、脂肪氧化或者是羰基化合物还原生成，还有一部分来自辛香料中[18]，比如，桉叶油醇、芳樟醇、4-松油烯醇。此外，3 组牛干巴中均检测出芳樟醇，1 号和3 号样品中的含量分别高达75.72%和75.84%，是含量最高的挥发性风味成分，但2 号含量只有15.93 1%，而这1、3号感官得分相近，说明芳樟醇对1、3 贵州牛干巴的风味成分具有较大贡献。

鉴定醇酮类5 种，在3 组牛干巴中均含有乙偶姻、花椒素，除乙偶姻来源于美拉德反应中糖降解反应外，其他4 种均来源于辛香料的添加。

另外还检测出6 种其他类化合物。3 种牛干巴中均检测出乙酸乙酯、乙酸和2，3，5，6-四甲基吡嗪，乳酸菌通过糖代谢生成乙酰磷酸，在乙酸激酶作用下可产生乙酸[19]。而微生物的酯化作用，可以使羧酸与醇类反应生成酯类，酯类化合物对于食品风味的贡献很大。3 组样品中检测到了乙酸乙酯和丁酸芳樟酯。具有特殊香味的杂环化合物和硫醚类化合物，分别来源于美拉德反应和硫醇类化合物反应[20]。

通过这3 组贵州牛干巴样品的挥发性风味成分进行分析，与其他地区牛干巴产品比较，发现其挥发性成分在种类与含量组成方面是有差异的。Węsierska等[21]，Kaban 等[4]发现，微生物代谢作用也会形成干腌牛肉风味，例如：3-甲基-1-丁醇，乙酸乙酯，己酸乙酯等。然而通过分析贵州牛干巴风味物质的来源，推测可知，辛香料的添加、氨基酸的strecker 反应、脂肪氧化和微生物代谢作用是形成贵州牛干巴独特风味物质的重要途径。其风味成分以萜烯类、醇类和醛类为主，其中烃类物质种类最多，醇类物质含量最高（除2号样品）。这样的成分组成明显区别于其他地区牛干巴：伊犁风干牛肉以酚类物质为主，其次是烃类和醇类；塔城风干牛肉中，则是醛类物质含量最高，再以醇类和烃类为其次风味物质；在阿勒泰风干牛肉中，烃类物质含量高于醛类和醇类物质[22]。云南牦牛干巴的风味组成中含量最高的是烃类，而醛类则是黄牛干巴的组成中含量最高的风味成分[2]。其中阿勒泰牛干巴与云南牦牛干巴中的烃类物质主要是长链脂肪烃与含苯芳香烃类，这类烃类物质主要来源于原料肉中动物饲料的沉淀，区别于贵州牛干巴中主要来源于香辛料的烯萜类物质。

对比国外的干腌牛肉制品，土耳其Pastirma 由于加工周期（1 个月左右）比较短，鉴定的挥发性化合物种类较少，总共有48 种挥发性成分被鉴定，而芳香烃类（甲苯）是成品中最丰富的成分。Węsierska 等[21]的研究发现：不同部位的牛肉制成的干腌牛肉的挥发性成分的组成是不同的，而脂肪氧化和微生物代谢是形成风味物质的主要途径。通过对比国内外干腌牛肉制品可知：原料肉的性质差异、加工工艺的不同及配料使用的不同可能是导致各类产品风味组成差异的原因。

贵州牛干巴制作历时约1 个月。较长的制作周期，给了脂肪足够的时间氧化分解，形成了多种醛类，同时氨基酸的strecker 降解或微生物的代谢产生了醇类和其余风味物质，但通过感官评价发现，没有感受到明显油脂香气。而花椒、五香调料等辛香料，也就是烃类物质风味较为明显。出现这样的情况是因为贵州地区天气潮湿，肉制品易腐败变质。传统牛干巴中大量使用辛香料，可以达到抑菌、延长保质期的效果，同时这也导致牛干巴中辛香料风味过重，掩盖了其余风味，造成整体风味不协调，缺乏牛肉香味的情况。

2.3 主成分分析

为了进一步直观反映出不同牛干巴与其挥发性物质之间的关联性，对相对含量大于0.5 的挥发性代谢物进行主成分分析，结果见图1。

图1 牛干巴风味成分主成分分析的得分散点图和因子载荷图Fig.1 Score and corresponding loadings plots rom principal component analysis of volatile aroma compounds

主成分1 的方差贡献率为65.5%，主成分2 的贡献率为34.4%，二者累计贡献率已覆盖风味品质信息。主成分 1 与（V48）1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）环己醇、（V47）芳樟醇、（V58）崖柏酮、（V55）苄醇、（V27）己醛等风味物质高度正相关，乙酸乙酯（V62）、2，3，5，6-四甲基吡嗪（V64）、二烯丙基二硫（V65）与主成分 2 高度正相关。说明1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）环己醇、芳樟醇、崖柏酮、苄醇、己醛、乙酸乙酯等化合物是贵州牛干巴挥发性风味物质的主要特征化合物。由图1a 可知，3 种牛干巴样品根据其发性风味成分明显分为3个区域，并且相距都比较远，说明差异大，但1、3 号感官评分却相近，这说明虽然差异大但也可得到类似的感官评分效果，不过其主体风味肯定不同。而且1、3 号风味成分都显著多于2 号，但感官评分低于2 号，这说明不能仅靠添加更多的香辛料来提升牛干巴品质。改进牛干巴品质除了添加适当协调的香辛料外，还得通过改进其它工艺条件来完成。

图1b 为香气物质载荷图，载荷系数反映了牛干巴中各挥发性化合物对各主成分的影响。牛干巴1 号在第一象限，正十三烷（V21）、癸醛（V34）、花椒素（V61）、乙酸乙酯（V62）对其影响显著，为其特征性成分，牛干巴 2 号在第三象限，与烃类（己烷（V1）、辛烷（V2）等）和顺-香苇醇（V54）、花椒素（V61）高度正相关，为其特征性成分，牛干巴3 号在第四象限，与反-β-罗勒烯（V17）、3-甲基十一烷（V10）、α-松油烯（V11）、苄醇（V55）、α-松油醇（V51）等化合物呈正相关。综上所述，不同牛干巴与挥发性物质之间的相关性主要集中在来源于辛香料的烃类和醇类化合物。

2.4 不同牛干巴中细菌群落多样性分析

2.4.1 测序数据质量分析

为了得到有效数据，对下机原始数据进行处理，相关质量分析及统计结果如表2所示。

表2 原始数据与有效数据统计Table 2 The original data and effective statistics

由表2可以看到，对低质量和无用序列进行过滤后，3 个样品的Q20 和Q30 碱基百分比有所提高，分别达到97%和99%以上，有效降低了Illumina 平台测序的错误率。

2.4.2 细菌群落的丰度分析

3 种贵州牛干巴的物种相对丰度分布（属水平）如表3所示。

表3 贵州牛干巴优势细菌菌属及其丰度Table 3 Abundance of predominant bacteria in samples Guizhou Niuganba

3 种牛干巴样品中，在门水平上主要是软壁菌门、拟杆菌门、蓝藻菌门、变形菌门、互养菌门、绿屈挠菌门、放线菌门、热袍菌门、厚壁菌门等。3 种牛干巴所含物种基本相似，主要优势菌是变形菌门和厚壁菌门。进一步对细菌群落中主要优势菌属进行分析。不同种类牛干巴中细菌菌属结构存在一定差异。在3 种牛干巴中，乳杆菌属、葡萄球菌属和嗜冷杆菌属为优势菌，但比例差别较大；另外3 号牛干巴科贝特氏菌属也为优势菌，这是贵州牛干巴特有的，其它地方牛干巴未见报道。不少学者对其他地区的牛干巴研究较多，肖蓉等[23]在牛干巴加工过程中，使用传统分离筛选方法筛选到优势菌：埃希氏菌、微球菌、乳杆菌、假单胞菌和片球菌；吕彩霞[24]利用传统分离筛选方法从云南牛干巴中筛选出4 株优势发酵菌，包括2 株肉糖葡萄球菌和2 株乳酸菌。刘姝韵等[25]利用变性梯度凝胶电泳技术对云南牛干巴加工过程中的细菌菌落多样性进行分析，发现葡萄球菌属、嗜冷杆菌及明串珠菌属为优势菌种；此外，牛干巴加工过程中还存在着不可培养的菌群。以上研究结果均与本研究有相似之处，也就是乳酸菌、葡萄球菌和嗜冷杆菌属都为牛干巴优势菌属。尤其是乳酸菌和葡萄球菌的代谢作用分解蛋白质为肽和氨基酸，不仅形成了大量风味物质，还对营养价值做出贡献。其次是嗜冷杆菌属，牛干巴1 号和牛干巴3 号样品中相对丰度较高，分别为12.77%和28.44%，远高于牛干巴1 号。嗜冷菌属能够分解脂类和水解蛋白质，从而引起轻微腥味和发霉的气味[26]。但更有不同之处：首先3 号牛干巴含有特有的优势菌科贝特氏菌属，这在其它地方牛干巴未见报道；再者环丝菌属、明串珠菌属、沙雷菌属、弧菌属、假单胞菌的相对丰度都低于5.6%，其中，嗜冷杆菌、弧菌属、假单胞菌属等在诸多肉制品腐败变质过程中都被发现，它们被认为会对肉制品的安全和品质造成损害，所以贵州牛干巴安全性较好，这可能主要得益于香辛料对腐败菌的抑制作用和气候条件也有关系。

2.4.3 牛干巴聚类分析

牛干巴聚类分析结果见图2。

图2 牛干巴聚类分析Fig.2 Similarity coefficient based dendrogram constructed among samples

由图2可知，牛干巴1 号（NGB1）和牛干巴2 号（NGB2）距离最近，其微生物种类和数量最为相似，这可能与它们的工艺较为相似有关。通过上述各水平的分析以及微生物群落结构的聚类分析已初步表明不同牛干巴的微生物群落结构有较大差异：虽然贵州牛干巴与云南牛干巴都以葡萄球菌属和乳杆菌属为优势菌，但是贵州牛干巴同时也以魏斯氏菌和嗜冷杆菌属为优势菌，具体的，其中牛干巴1 号优势菌为乳杆菌，2 号为葡萄球菌属，3 号为嗜冷杆菌属。而云南牛干巴还以明串珠菌属菌为优势菌属。

2.5 牛干巴挥发性风味物质与微生物的关系

3 种牛干巴样品中的主要酸类物质都是乙酸。作为优势微生物的乳酸菌（乳杆菌、魏斯氏菌等）对发酵肉制品风味的贡献，主要是通过分解代谢碳水化合物、氨基酸等产生有机酸。细菌对碳水化合物的代谢和脂质氧化可产生并不断积累醇类物质，例如异型发酵的乳酸菌可产生乙醇，而苯乙醇等支链醇也可能是来源于微生物作用。有研究表明乳酸菌也会影响发酵香肠的脂肪氧化速率，脂肪氧化形成醛类、酮类物质，对干腌肉制品风味有重要贡献。所有牛干巴样品中均含有乙酸乙酯，酯类物质的形成主要与发酵相关。乳杆菌在牛干巴中占绝对优势地位，其代谢产物乙酸是形成乙酸乙酯及其他香味成分的重要物质基础；明串珠菌可利用碳水化合物进行异型发酵产生乙酸，也可作为乙酸乙酯的前体物。

而且，3 种牛干巴虽然菌群丰富，但是由主成分分析知这3 种牛干巴的特征风味成分基本上都不是微生物代谢产生的而是来源于香料成分，微生物发酵对风味物质有所贡献但不突出，这从牛干巴1 号和牛干巴2 号的微生物种类和数量最为相似但其感官评分和风味成分却差别较大也能看出：微生物相似代谢物也应类似，但感官评分差别较大，这也说明微生物代谢产生的风味在其中不占主要作用，这可能是添加过多的香辛料抑制了微生物的代谢发酵作用。因此，为发挥微生物发酵代谢的优异性能，后续需要加以改进发酵工艺。

3 结论

1）对贵州牛干巴进行了挥发性风味成分的种类与含量的分析。共检测到67 种化合物，包括烃类（25）、醛类（14）、醇类（17）、酮类（5），其他类（6），其中共有成分有16 种。3 组牛干巴的挥发性风味成分在种类和含量上有差异，原因可能是原料肉、腌制方法、制作工艺等因素的不同。根据主成分分析可知：丰富多样的辛香料为其风味做出了重要贡献，但是过重的辛香料风味覆盖了牛干巴该有的肉香。

2）运用高通量测序技术对采集的3 种传统发酵牛干巴的细菌群落进行检测。结果表明传统发酵牛干巴中细菌多样性丰富，主要优势菌是变形菌门和厚壁菌门，而乳杆菌属和葡萄球菌属占绝对优势。不同种类牛干巴中细菌菌属结构存在一定差异，而且3 号牛干巴还存在科贝特氏菌属优势菌，这是贵州牛干巴特有的。另外利用高通量测序发现存在部分不可培养菌种。

3）3 种牛干巴虽然菌群丰富，但是由多种分析知这3 种牛干巴的特征风味成分基本上都不是微生物代谢产生的而是来源于香料成分，微生物发酵对风味物质有所贡献但不突出，添加过多的香辛料抑制了微生物的代谢发酵作用。后续需要加以改进发酵工艺发挥微生物发酵代谢的优异性能。

4）对贵州牛干巴中挥发性风味成分的形成过程还需进一步研究：可探究其风味形成途径、风味协调性与不可培养菌株的种类，为贵州牛干巴风味品质协调、生产工艺的调控、延长保质期等提供理论依据。开展贵州牛干巴货架期的研究，增强牛干巴的商业性推广。