曾维顺， 陈捷腾， 李贇雪， 刘世永， 陈 浩,*

(1.山东大学(威海) 海洋学院， 山东 威海 264209； 2.威海海洋职业学院 食品工程系， 山东 威海 264300)

氧化淀粉是天然淀粉与氧化剂在一定的pH值、温度、时间、催化剂等条件下产生的一种淀粉衍生物[1]，它可以有效降低淀粉糊化温度与黏度且透明性高稳定性好[2]，在高浓度下是一种优良的低黏度增稠剂[3]。明胶是一种复杂的蛋白质共混物，广泛应用于胶凝剂、稳定剂、乳化剂、增稠剂中[4-5]。蛋白-多糖复合物的制备及其性能的研究早在20世纪80年代就开始兴起，研究发现两者共价交联复合物比其前体物质具有更加优越的性能(乳化性、起泡性、热稳定性等)[6]，蛋白质与多糖在干热条件下就能发生共价交联反应，而交联的程度取决于反应的温度、时间和pH值等。Zhang等[7]在高温(90～140 ℃)、短时(2 h)条件下制备的大豆分离蛋白和麦芽糊精共价复合物具有良好的乳化性能，相较于传统的低温(小于50 ℃)、长时间(大于24 h)制备更为简单省时。Zhu等[8]采用干热法制备基于乳清蛋白和葡聚糖的蛋白-多糖复合物，发现在弱酸性条件下制备的复合物展现出更为优越的乳化性。

研究选取氧化淀粉和明胶作为实验材料，在前人研究基础上采用Box-Behnken设计进行多因素多水平分析，综合分析反应时间、温度以及pH值对复合物乳化稳定性的影响，最终通过数学分析优化制备方案，并验证方案的正确性，为后续进一步开发利用氧化淀粉- 明胶复合物乳化剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

明胶(bloom值250 g)，越南Vinhwellness公司；氧化淀粉(P450)，嘉吉亚太食品系统(北京)有限公司；溴化钾(分析纯)，天津市巴斯夫化工有限公司；大豆植物油(食品级)，山东鲁花集团有限公司。

1.2 仪器与设备

CP224C型电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；RH-KT/C型磁力搅拌器，艾卡(广州)仪器设备公司；B-260型恒温水浴锅，上海亚荣生化仪器厂；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；T6型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；5810R型台式低温离心机，德国Eppendorf公司。

1.3 实验方法

1.3.1氧化淀粉-明胶共价复合物的制备

参照文献[9-10]，将氧化淀粉与明胶以质量比1∶1混合均匀，用蒸馏水溶解调至0.06 g/mL，再用0.1 mol/L的HCl溶液调节pH值，然后进行冷冻干燥。干燥后的样品研磨后放置于干燥器内，在干燥器底部放置饱和的KBr溶液，保持相对湿度79%，密封干燥器放入烘箱中进行干热处理。

1.3.2Box-Behnken响应面试验设计

参照文献[11]，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，选取pH值(A)、反应温度(B)、反应时间(C)为考察对象，以乳化稳定性为响应值，采用三因素三水平响应面分析法确定最佳工艺条件。响应面试验因素水平见表1。

表1 响应面分析因素水平

1.3.3乳化稳定性测定

以复合物乳化稳定性(emulsion stability, ES)为指标，评定其乳化性能[12]：将0.2 g氧化淀粉- 明胶共价复合物加入到4 mL蒸馏水中，磁力搅拌至充分溶解后，加入4 mL大豆油，剪切均质(16 000 r/min, 5 min)获得均一乳液。将乳液室温放置10 min后，置于60 ℃水浴锅加热30 min，最后放入离心机中进行离心处理(3 000 r/min，15 min)。乳化稳定性计算见式(1)。

(1)

式(1)中：V0为离心管中全部溶液体积,mL；V1为离心后乳液体积,mL。

1.3.4紫外可见光谱验证

以磷酸盐缓冲溶液(pH值7.0，浓度0.01 mol/L)作为空白对照校正吸光度，在该浓度磷酸缓冲液条件下制备蛋白质质量浓度为1 mg/mL的样品溶液，并在紫外分光光度计中测定样品在200～400 nm紫外吸收光谱[13]。

1.4 数据处理

采用SPSS 19和Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计和数据分析。

2 结果与分析

2.1 响应面试验结果

采用三因素三水平的响应面试验进行条件优化，以乳化稳定性为响应值设计共17个实验点，结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计与结果

通过Design-Expert 8.0.6软件处理，得到pH值、反应温度及反应时间对共价复合物乳化稳定性的二次多项式回归方程，见式(2)：

Y=+60.40-0.21A+1.07B-0.44C+0.28AB+
0.66AC+0.46B-1.92A2-0.58B2-1.10C2。

(2)

利用Design-Expert 8.0.6软件对响应面试验结果进行多元回归拟合[14]和统计分析，得到二次模型回归统计分析表(表3)。从表3中可以看出，模型项P值为0.001 2，小于0.01，说明该模型极具显著性，同时该模型的决定系数R2=0.946 3,说明该模型的可靠度高。另外失拟项P值为0.050 4,大于0.05,对模型是有利的,无失拟因素存在[15]。对自变量的显著性结果检验表明，一次项B,二次项A2、C2是极显著的模型因素，AC是显著的模型因素，说明试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，二次项对响应值也有很大的影响[16]。另外F值表示各因素对响应值的影响程度，从表3中可看出各单因素对乳化稳定性的影响由大到小依次为反应温度、反应时间、pH值。

图1 pH值和反应温度交互作用对乳化稳定性的影响Fig.1 Effects of interaction between pH and temperature on emulsion stability

参数离差平方和自由度均方F值P值显著性Model37.9494.2213.710.0012极显著A0.3710.371.200.3090B9.1619.1629.800.0009极显著C 1.5311.534.980.0608AB0.3210.321.060.3381AC1.7711.775.750.0475显著BC0.8610.862.810.1374A215.44115.4450.230.0002极显著B21.3911.394.530.0709C25.1415.1416.720.0046极显著残差2.1570.31失拟项1.7930.606.560.0504不显著纯误差0.3640.091总离差40.0916

F值为F检验统计量。P值为显著性检验结果可信程度的递减指标，当P<0.05表示模型或所考察因素影响显著，P<0.01表示影响极显著，P>0.1表示影响不显著。

通过绘制响应面曲线对各个因素的交互影响作用进行更为直观的可视化分析。在响应面图中，响应面越陡峭表明该实验因素对结果的改变越敏感。而在等高线图中，等高线顶点和附近区域为响应面最佳水平范围，等高线围成的椭圆越椭表示实验因素之间的作用越明显；反之曲线坡度越缓或等高线越近圆形，说明交互作用不明显[17]。

随着反应温度的升高，复合物的乳化稳定性逐步升高，这可能和氧化淀粉与明胶的共价交联程度有关，见图1。在一定范围内反应温度越高，反应越迅速；其他条件不变的情况下氧化淀粉与明胶的交联程度越大，复合物的占比越多，乳化性能越高[18]。而随着pH值的升高，复合物的乳化性能先升高后降低，可能的原因是低pH值时，蛋白质在等电点附近发生沉淀，导致明胶与氧化淀粉交联不充分；而在较高pH值，蛋白质的电离能力弱，与阴离子多糖的静电吸引力弱，也导致了共价交联的不充分。从图1可以看出复合物的乳化稳定性对温度的改变更为敏感。

pH值和反应时间的等高线形状较扁，实验因素之间的交互作用明显，乳化稳定性随反应时间延长持续升高至最佳水平，之后不断减小(见图2)。

图2 pH值和反应时间交互作用对乳化稳定性的影响Fig.2 Effects of interaction between pH and reaction time on emulsion stability

图3 反应温度和反应时间交互作用对乳化稳定性的影响Fig.3 Effects of interaction between temperature and reaction time on emulsion stability

反应时间和反应温度的响应面和等高线见图3。由图3可以看出反应时间保持在3 h不变时，乳化稳定性随反应温度的增加而增大，直至最佳水平。等高线形状呈椭圆形，说明反应时间与反应温度交互作用明显。

2.2 实验条件优化与验证结果

经Design-Expert 8.0.6软件分析，得到优化实验条件为pH值5.01、反应温度104.67 ℃、反应时间3.00 h，在此条件下，复合物乳化稳定性的理论值为60.90%。

考虑到实际可操作性，将优化实验条件定为pH值5.00、反应温度104.70 ℃、反应时间3.00 h，用此方案进行验证，得到复合物乳化稳定性均值为60.90%，与理论值相当。再通过SPSS 19对单个样本进行检验，结果显示在置信因数为95%的情况下存在显著性差异，表明该数学模型对优化氧化淀粉- 明胶复合物的乳化稳定性是有效的。

2.3 紫外可见光谱验证结果

复合物紫光谱2个最大吸收峰分别在230 nm和280 nm处，而混合物仅在230 nm左右有一个吸收峰(见图4)。230 nm处特征峰主要表征肽键变化，而280 nm处主要是生色团结构形成的吸收[19]。另外复合物在230 nm和280 nm处的最大吸收峰也表明席夫碱的形成[20]，可以证明氧化淀粉- 明胶复合物是美拉德反应产物。

图4 氧化淀粉- 明胶复合物与混合物紫外光谱Fig.4 Ultraviolet spectrum of oxidized starch-gelatin compound and mixtures

3 结 论

1)本研究的实验模型拟合度好，能够正确反映pH值、反应温度以及反应时间对复合物乳化稳定性的影响。其中反应温度是影响复合物乳化稳定性的极显著因素，在一定范围内升高反应温度能够加快蛋白质与多糖的共价交联，使共价复合产物的比例增加，从而提升整体的乳化稳定性。另外pH值和反应时间也是影响交联程度的重要因素。

2)根据实际情况和实验操作的可行性，制备氧化淀粉- 明胶复合物的优化条件为pH值5.00、反应温度104.70 ℃、反应时间3.00 h，在此条件下制备的复合物乳化稳定性为60.90%，符合理论值。但将氧化淀粉- 明胶复合物作为乳化剂添加到食品中的可行性仍需要进一步考核和研究。