李爱华， 汪兴杰， 刘 浩， 陶永胜,3，*

(1.西北农林科技大学 食品科学与工程学院， 陕西 杨凌 712100；2.西北农林科技大学 葡萄酒学院， 陕西 杨凌 712100；3.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心， 陕西 杨凌 712100)

香气是葡萄酒的重要感官特征，葡萄酒中香气物质主要分为品种香气成分、发酵香气成分和陈酿香气成分。品种香气成分的前体主要是糖苷结合态的香气化合物，香气糖苷是结合态的香气物质，发酵过程中酵母分泌的糖苷酶能够促进葡萄香气糖苷的水解，释放出游离的品种香气成分，表现出典型的品种香气特征[1]。发酵香气成分主要来源于酵母主导的葡萄糖代谢路径[2]。其中，酯类物质虽然在含量上低于高级醇含量，但由于其嗅觉阈值较低，因此是发酵香气成分中主要的呈香物质，且通常是果香的贡献者[3]。辛酸乙酯是葡萄酒发酵中果香酯类的代表性物质，在模拟葡萄酒中的嗅觉阈值仅为2～5 μg/L[4-6]，而检出量通常高于阈值，因此是葡萄酒果香和花香的有力贡献者，并且葡萄酒发酵过程中辛酸的合成及其顺利乙酸酯化是酵母风味物质代谢的典型案例。乙酸苯乙酯作为苯乙基类化合物的重要呈香物质，呈现令人愉悦的甜香[7-8]，在葡萄酒中的检出量通常为几十μg/L，而嗅觉阈值为250 μg/L[7,9]，香气活性值在0.1～1之间。研究认为糖苷前体水解和酵母代谢是乙酸苯乙酯生成的限速底物苯乙醇在发酵过程中的主要来源[10]。因此研究辛酸乙酯和乙酸苯乙酯在发酵过程中的生成过程，有助于了解酵母发酵特性，从而优化发酵工艺。

由于单一酿酒酵母菌株的发酵，易造成葡萄酒风味质量的单一化和趋同化[11-12]，最近十年，一些具有较高风味酶活性的非酿酒酵母菌株引起了研究者的注意，优选非酿酒酵母与酿酒酵母的混合发酵成为增加葡萄酒风味复杂性的研究热点[13-14]。深入研究发现，混合发酵表现出增香效果的同时，非酿酒酵母过多地参与发酵有可能给葡萄酒带来异味，如动物、真菌等气味[15]。为了避免非酿酒酵母在混合发酵中的负面作用，本研究在酿酒酵母发酵过程中添加优选野生酵母的胞外酶提取物，研究其对辛酸乙酯和乙酸苯乙酯生成的影响。实验以模拟葡萄汁为发酵基质，添加n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷和苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，采用优选非酿酒酵母胞外酶促进酿酒酵母发酵过程中辛酸乙酯、乙酸苯乙酯的生成，实验同时以商业糖苷酶和果胶酶处理为参照，探究优选酵母胞外酶处理对两种果香酯类物质生成的影响，为优选酵母及其胞外酶进行葡萄酒增香酿造提供理论和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 酵母与酶制剂

酿酒酵母活性干粉ACTIFLORE F33购自法国Laffort公司；商业果胶酶(LAFASE HE GRAND CRU)购自法国Laffort公司，β-D-葡萄糖苷酶的活性300 U/g；商业糖苷酶制剂AR2000购于荷兰DSM集团，β-D-葡萄糖苷酶的活性1 000 U/g。

1.2 仪器与试剂

GC- MS- QP2020气质联用仪，日本岛津公司；UV- 2450型紫外分光光度计，日本岛津公司；TGL- 16M型台式高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；DGX- 9243BC型鼓风干燥箱、NRY- 2102C型立式恒温摇床、MP- 250B型恒温培养箱，均为上海南荣实验室设备有限公司。

酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限公司；葡萄糖，天津科密欧化学试剂有限公司；果糖，北京索莱宝科技有限公司；一水合柠檬酸、硫酸镁、氯化铵、磷酸二氢钾、无水硫酸钠、氯化钠和无水乙醇，四川西陇化学试剂有限公司；酒石酸、单宁酸和亚硫酸(SO2含量不低于6%)，天津天力化学试剂有限公司；氢氧化钠，广州市金华大化学试剂有限公司。

n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(纯度≥98%)，苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(纯度≥98%)，L-苹果酸，均购自上海源叶生物科技有限公司；辛酸(纯度≥98%)、辛酸乙酯(纯度≥98%)、苯乙醇(纯度≥99%)、乙酸苯乙酯(纯度≥98%)和2-辛醇(纯度≥99%)，均购自Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1非酿酒酵母胞外酶提取物制备及其酶活测定

发酵毕赤酵母(Pichiafermentans)和葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)是以葡萄酒、果酒增香酿造为目标由实验室优选获得[13,16]。酵母胞外酶液参照Sun等[17]方法制备，粗酶液经 PEG 20000浓缩20倍，分析糖苷酶、酯酶和蛋白酶的活性。

糖苷酶活性分析：反应体系为0.75 mL pH=5.0的柠檬酸- 磷酸盐缓冲液，分别添加0.25 mL 1 mmol·L-1待测糖苷酶的对应底物，对硝基苯-β-D-葡萄糖苷、对硝基苯基-α-L-阿拉伯糖苷、对硝基苯基-β-D-半乳糖苷、对硝基苯基-β-D-木糖苷和对硝基苯基-α-L-鼠李糖苷，同时分别添加0.1 mL酵母胞外粗酶液。40 ℃反应30 min，反应结束后加入1 mL 0.5 mol·L-1的碳酸钠终止反应，随后测定反应液在400 nm的吸光值。其中，以蒸馏水代替反应底物作为对照组，每个样品重复3次。一个单位β-D-葡萄糖苷酶酶活单位定义为：在40 ℃的条件下，每分钟催化生成1 μmol对硝基苯酚所要的酶量。

酯酶活性分析：参照Pérez-Martín等[18]的测定方法，以C4碳链长度的酯水解能力表示。

蛋白酶活性分析：参照Guleria等[19]的测定方法，一个单位蛋白酶活性定义为在60 ℃条件下，每分钟催化生成1 μmol酪氨酸所需的酶量。

1.3.2模拟发酵体系中的酶促水解实验

模拟葡萄汁的配制参考Chassagne等[20]，略作修改。模拟葡萄汁以水为溶剂，1 L组分包括110 g葡萄糖，110 g果糖，3 g酒石酸，0.3 g苹果酸，0.5 g氯化铵，0.6 g酵母浸粉，2.0 g单宁酸，2.0 g磷酸二氢钾，0.2 g 硫酸镁。充分混匀后，用2 mol/L NaOH调节pH值至3.4，灭菌后备用。

香气糖苷标准品的配制方法参考Hampel等[21]，n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷和苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷的配置浓度分别为1.33 mg/mL和6.09 mg/mL。模拟葡萄汁分别添加两种香气糖苷标准品溶液各1 mL/L，再添加SO260 mg/L，30 min后不同处理按β-D-葡萄糖苷酶活5 U/L分别添加商业糖苷酶制剂AR2000、果胶酶(PEC)、葡萄汁有孢汉逊酵母胞外酶提取液(HU)、发酵毕赤酵母胞外酶提取液(PF)于模拟葡萄汁中，同时以未添加香气糖苷和酶制剂的模拟葡萄汁为对照(CK)。12 h后接种活化酿酒酵母200 mg/L启动发酵。发酵实验在20 ℃恒温条件进行。发酵过程中，每隔48 h测定酒精度和还原糖消耗量，测定方法参考文献[22]。同时留存发酵葡萄汁50 mL于-20 ℃冷冻，用于香气成分分析。当发酵液比重降为0.992～0.994，且残糖<2 g/L，终止发酵。

1.3.3香气成分分析

模拟发酵样品中香气物质采用固相微萃取(solid phase micro-extraction)提取，进行GC-MS分析，具体方法参照Wang等[23]。

SPME方法：在15 mL装有磁力搅拌子的顶空瓶中加入8 mL酒样(含内标物)或标准品溶液，加入2.0 g NaCl，然后将顶空瓶放入电磁搅拌器上水浴，40 ℃条件下平衡15 min；插入萃取纤维CAR/DVB/PDMS(50 μm/30 μm萃取头，Supelco公司，USA)，40 ℃吸附30 min，立即将萃取头在GC进样口解吸8 min，用于GC-MS分析。

GC-MS分析条件：无分流进样；色谱柱为DB-WAXETR气相色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W公司，USA)；柱升温程序为以3.0 ℃/min从40 ℃升至130 ℃，再以4 ℃/min从130 ℃升至250 ℃，保持8 min。离子源温度250 ℃，连接杆温度250 ℃，进样口温度250 ℃，电压70 eV，质谱扫描范围25～350 u，扫描速率0.2次/s。

定性定量方法：采用与香气标准品保留时间对比的方法定性，以2-辛醇为内标，采用内标- 标准曲线法定量。

1.4 数据分析方法

采用SPSS 19.0软件进行目标香气物质数据的单因素方差分析和多重比较，采用Origin Pro 9.3绘制目标香气物质含量的动态变化图。

2 结果与分析

2.1 酵母胞外提取物中酶活分析

表1是两株酵母胞外提取物中酶活分析结果，两株酵母分泌的胞外酶中与葡萄酒风味形成直接相关的酶有糖苷酶、酯酶和蛋白酶。

表1 酵母胞外提取物中的酶活分析

同一行数据不同字母表示差异性显著水平(P<0.05)。

实验检测了5种糖苷酶的酶活，结果显示两株酵母胞外酶中糖苷酶的活性较高，并且差异显著，其中PF中β-D-葡萄糖苷酶活性较高，而HU中α-L-阿拉伯糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶和β-D-半乳糖苷酶的活性较高。而对于酯酶和蛋白酶，PF中的活性明显高于HU的。酵母胞外酶中的酶活及其差异最终将影响代谢产物的生成，实验将分析胞外酶处理对辛酸乙酯和乙酸苯乙酯生成的影响。

2.2 发酵过程中还原糖消耗和酒精生成的变化

模拟发酵体系中还原糖消耗和酒精生成的动态变化分别如图1(a)和图1(b)。发酵结束时，各处理的还原糖消耗总量基本一致，但酒精最终生成量略有不同，酵母胞外酶处理的酒精度略有降低。酵母胞外酶处理组HU和PF在发酵中期，即第4～12天，还原糖消耗更快，且酒度生成速度也更快，说明酵母胞外酶处理明显影响了酒精发酵进程。

图1 模拟发酵过程中还原糖的消耗过程和酒度的生成过程Fig.1 Residual sugar consumption and alcohol degree formation during simulated fermentation

图2 模拟发酵过程中目标香气物质的生成过程Fig.2 Progress of objective aroma compounds during simulated fermentation

2.3 目标香气物质的生成过程分析

图2是目标香气物质在对照和酶处理发酵过程中的生成过程。

总体上，辛酸、辛酸乙酯、苯乙醇和乙酸苯乙酯的含量均呈现先增后减并趋于稳定的动态变化趋势。辛酸乙酯在发酵后期的含量下降幅度虽然比乙酸苯乙酯大，但辛酸乙酯的最终生成量明显高于乙酸苯乙酯。

不同酶制剂处理对目标香气成分的生成过程及其最终生成量均有促进作用，其中HU和PF胞外酶在发酵过程中对目标香气成分生成的促进作用表现明显。HU和PF在发酵后期对辛酸乙酯的促进生成量虽低于AR2000，但显著高于PEC，而HU和PF促进乙酸苯乙酯的作用最为显著，发酵结束时的酶促增量分别达到了CK生成量的1.76和2.00倍。由图2可见，辛酸与辛酸乙酯的最大生成区间是发酵的第4～8天，而后趋于下降，而苯乙醇和乙酸苯乙酯的最大生成区间是发酵的第6～14天，之后趋于平稳。相比于发酵过程中的最大生成量，本研究对目标香气成分在发酵结束时的损失率进行了计算，结果见表2。总体上，不同处理间的损失率差异显著，其中以CK的损失率最大，而尤以辛酸和辛酸乙酯的损失率最大。比较而言，HU和PF处理有助于辛酸乙酯和乙酸苯乙酯的生成，AR2000处理在辛酸乙酯生成上优于HU和PF处理，但在乙酸苯乙酯的生成上HU和PF处理优于AR2000处理。

表2 发酵结束时目标香气物质的损失率

同一列数据不同字母表示差异性显著水平(P<0.05)；“—”表示没有损失。

2.4 目标香气物质的生成来源分析

假设目标香气物质的生成来源有3部分，纯酵母发酵代谢、糖苷前体水解和酶制剂促进生成，因此用目标香气物质的量来比较生成量之间的差别。发酵结束时各处理组中辛酸、辛酸乙酯、苯乙醇、乙酸苯乙酯的物质量分析结果见表3。可以确定，(辛酸+辛酸乙酯)和(苯乙醇+乙酸苯乙酯)的纯发酵生成量远高于对应香气糖苷——n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷和苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷的完全水解的最大生成量。n-辛基-β-D-葡萄糖苷水解和苯基-β-D-葡萄糖苷完全水解后生成对应香气物质的含量分别为4.6 μmol/L和23.8 μmol/L，而在对照的纯酵母发酵代谢中，发酵结束时(辛酸+辛酸乙酯)的生成量为6.9 μmol/L，而(苯乙醇+乙酸苯乙酯)的生成量达到了591.1 μmol/L。

表3 模拟发酵过程中目标香气物质的最大生成量

同一行数据不同字母表示差异性显著水平(P<0.05)；“—”表示无差值。

在目标香气物质最大生成量时，辛酸乙酯的物质量是辛酸的2～3倍，而乙酸苯乙酯的量远低于苯乙醇。由表3分析可见，不同酶制剂处理均促进了辛酸和辛酸乙酯的生成，其中PEC处理促进量最低，HU促进辛酸的生成量最大，HU和PF显著促进了辛酸乙酯的生成，促进量接近对应糖苷水解最大生成量的3倍，说明酵母胞外酶处理主要是从促进酵母酯代谢的角度促进辛酸乙酯的生成，有利于葡萄酒相关酯类的生成。酶制剂处理也不同程度地促进了发酵过程中苯乙醇的生成，增加量由大到小依次为PF、AR2000、HU、PEC，促进量远大于对应糖苷水解最大生成量。尽管乙酸苯乙酯含量远低于苯乙醇含量，但实验数据不难看出，优选酵母胞外酶处理显著增加了乙酸苯乙酯的含量，而PEC处理没有促进作用。本研究推断，酶制剂处理促进苯乙醇生成的作用主要是促进了酵母合成苯乙醇的代谢，对应糖苷前体的水解仅占其中一小部分，可以肯定优选酵母胞外酶处理具有大幅促进乙酸苯乙酯生成的优势。

3 结 论

辛酸乙酯和乙酸苯乙酯是葡萄酒中花香和果香的重要贡献者，在本研究的模拟发酵体系中，二者的含量均呈现先增后减的变化趋势。酯类物质在发酵后期的损失可能与发酵过程中CO2逸失有关[18]。本研究中，酶制剂处理在模拟发酵体系中均大幅增加了目标香气物质的最终生成量，但大部分是促进了酵母酯类代谢的生成量，这不仅与酶制剂中糖苷酶的活性有关，还可能与AR2000酶[24]、HU和PF中存在的酯酶、蛋白酶等有关。相比于AR2000酶和果胶酶，两种非酿酒酵母胞外酶在促进辛酸乙酯大幅生成之外，还极大促进了乙酸苯乙酯生成，使乙酸苯乙酯的最终生成量达到了350～400 μg/L，超过了其在葡萄酒中的嗅觉阈值。因此非酿酒酵母胞外酶对辛酸乙酯和乙酸苯乙酯表现出更全面的促进能力，更适合于葡萄酒的增香酿造。

两种典型酯类物质及其前体物质在发酵过程中最大生成量来源的分析发现，辛基类(辛酸+辛酸乙酯)和苯基类(苯乙醇+乙酸苯乙酯)香气物质除来源于葡萄汁的纯酒精发酵作用和酶制剂对香气糖苷的水解外，还大量来源于酶制剂对酵母酯类代谢的促进作用，添加香气糖苷的水解产物仅在目标香气物质生成量中占很小一部分。因此，优选酵母胞外酶在葡萄汁发酵过程中促进相关酯类香气物质生成的机理值得进一步深入研究揭示。

模拟葡萄汁发酵过程中，相比于AR2000和PEC，HU和PF促进辛酸乙酯、辛酸、乙酸苯乙酯和苯乙醇生成的效果更好。优选酵母胞外酶对目标酯类物质促进生成的作用主要表现在促进酵母酯类物质代谢的生成量上，对应糖苷前体的水解仅占其中一小部分，所以优选酵母胞外酶处理具有促进葡萄酒发酵过程中相关酯类物质生成的增香应用潜力。