超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中庆大霉素残留量

2019-08-27

肉类工业 2019年7期

双汇集团河南漯河 462003

庆大霉素是典型的由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的氨基糖苷类抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有作用，可以有效抑制细菌的生长和繁殖。庆大霉素热稳定性好、价格低廉，是目前我国畜牧业、农业[1]和水产业中[2]常用的兽药之一，在我国畜牧养殖中，常被添加到饲料中，用于促进动物的生长发育。临床应用的庆大霉素会引起严重的不良反应，可能导致前庭和耳蜗神经损伤，且会导致肾损伤，出现血尿、蛋白尿、肾功能减退等症状。农业部235号公告中明确规定，猪肌肉组织中庆大霉素的最高残留限量为100μg/kg。

近年来，液相色谱串联质谱技术因能有效实现抗生素的确证和定量，成为研究关注的焦点[3～6]。庆大霉素具有较强的极性，在常规反相色谱柱上的保留性较差，通常加入离子对试剂七氟丁酸以增强其在色谱柱上的保留性，但其对质谱离子化具有抑制作用，降低负离子模式检测项目的灵敏度。亲水-亲脂平衡介质以多孔二乙烯基苯-N-乙烯基吡咯烷酮为框架结构，具有良好的亲水、亲脂特性及更好的稳定性和广泛的pH适用性，优于其他的反相固相萃取柱，可用于极性或非极性化合物的提取、富集和净化。

本研究拟参照国家标准GB/T21323-2007《动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定高效液相色谱-质谱/质谱法》，建立了一种固相萃取结合HPLC-MS/MS方法测定动物源食品中庆大霉素的方法。该方法使用HLB固相萃取小柱对提取的样品进行净化，然后使用C8色谱柱，对样品进行快速分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

庆大霉素纯度≥90%，Dr.Ehrenstorfer公司；

乙腈(质谱纯)，Fisher公司；

甲酸(质谱纯)，Fisher公司；

乙酸铵(色谱纯)，Kermel公司；

HLB固相萃取柱(60mg，3mL)，沃特世科技有限公司；

Xevo型液相色谱四极杆串联质谱联用仪，沃特世科技有限公司；

H-1850R型离心机，湘仪离心机仪器有限公司；

KQ-5200DE型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；

T18型高速匀浆机，德国IKA公司；

TARGINTM VXⅢ多管漩涡混合振荡器，Targin公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

猪肉样品取肌肉部分，用食品料理机匀浆，制成均匀样品，-18℃冷冻保存。

1.2.2 标准储备液的配制

称取适量庆大霉素标准品，用水溶解，配制成浓度为100μg/mL的标准贮备溶液(4℃避光可保存6个月)。

1.2.3 标准工作溶液的配制

量取1.0mL标准贮备溶液于25mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成标准中间溶液；精密量取标准中间溶液适量，用空白样品基质配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液(现用现配)。

1.2.4 样品处理

称取试样2.00g±0.01g于50mL离心管中，加入10mL磷酸盐缓冲液，振荡20min，以7 000r/min离心5min，上清液转入另一个50mL离心管中，在残渣中再加入10mL磷酸盐缓冲液，重复上述操作，合并上清液，经HLB固相萃取小柱净化；40℃下氮吹至近干，用1mL0.3%乙酸水溶液复溶，过0.22μm微孔滤膜于进样小瓶中，利用液相色谱-质谱/质谱测定。

固相萃取操作流程如下。

活化：3mL甲醇、3mL水。

上样：将提取液加载在固相萃取柱上，控制流速约1滴/s。

淋洗：3mL水。

洗脱：5mL5%甲酸甲醇溶液。

1.2.5 高效液相色谱-串联质谱条件

色谱条件如下。

色谱柱：Acquility UPLC BEH C8(2.1×50mm，1.7μm)；柱温40℃，进样体积5μL；流速0.2mL/min。

流动相：A相为5mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸水，B为乙腈。

梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

质谱条件如下。

离子源为ESI，正离子模式。

扫描方式：正离子扫描。

检测方式：多反应监测(MRM)。

毛细管电压：0.5KV。

离子源温度：500℃。

雾化气流量：1 000L/h。

锥孔气流量：30L/h。

碰撞气为高纯氩气。

庆大霉素的定性、定量离子对，采集时间，碎裂电压，碰撞能量如表2所示。

表2 MRM模式下庆大霉素的监测条件

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

由于肉制品样品基质复杂，含有较高浓度的蛋白质、脂肪及大量的内源性化合物，干扰分析物的测定，因此必须使蛋白质变性沉淀，同时释放出药物，减少基质影响。依据庆大霉素易溶于水的性质，三氯乙酸水溶液可对目标物进行有效的提取，我们对三氯乙酸的浓度进行了优化。实验结果表明：5%三氯乙酸-10mmol/L磷酸盐(含4mmol/L Na2EDTA)溶液可以对目标物进行充分提取，也可以较好地沉淀蛋白质。提取液pH值的变化对庆大霉素的影响较大，当调整提取上清液pH值至3.0时，回收率最好，回收率均大于65%，最高接近100%。

2.2 质谱条件的选择

庆大霉素在质谱上具有很强的正离子响应，因此选择正离子模式进行扫描。以1.0μg/mL庆大霉素单标溶液进样分析，在正离子模式下，一级质谱出现[M+H]+准分子离子峰，且丰度较大，因此选择分子离子峰作为母离子。对离子进行轰击碎裂，得到特征碎片离子峰信息，确定各目标物的特征子离子，具体见表2。在MRM模式下优化碰撞能量、裂解电压，最后在液相色谱联机条件下优化喷雾电压、离子化温度、脱溶剂气温度等参数，确定了最佳质谱检测条件。

2.3 色谱条件的选择

以C8色谱柱与C18色谱柱作为分析柱，通过系列实验，比较了Acquility UPLC BEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)、Acquility UPLC BEH C8(2.1mm×50mm，1.7μm)两种色谱柱，结果表明庆大霉素在C18色谱柱上没有保留，在C8色谱柱上有良好保留性，因此选择该色谱柱作为分析柱。

比较了乙腈-水、乙腈-甲酸水、乙腈-甲酸铵甲酸水、乙腈-乙酸铵甲酸水、甲醇-水为流动相时对色谱分离效果的影响，最终确定流动相A为5mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸水，B为乙腈时，色谱分离和质谱响应效果最佳。通过优化梯度洗脱条件，获得了目标物合适的保留时间和峰形，MRM模式下监测提取色谱图见图1。比较了流速0.2～0.45mL/min，对出峰时间影响不大，考虑到庆大霉素在色谱柱中保留时间，最终确定流速为0.2mL/min，出峰时间为0.5min左右。