游剑，杜鹏举，祝叶蕾

(湖北工程学院 生命科学技术学院 特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，湖北 孝感 432000)

苹果是蔷薇科苹果属的一种植物，成熟后的果实呈球形，可供食用，富有迷人的苹果香气，口感清爽甘甜，是一种中性的水果，也是市面上最常见的水果之一。苹果营养非常丰富，苹果中不仅含有苹果酸、奎宁酸、柠檬酸、酒石酸、单宁酸、果胶、纤维素和各种维生素，还含有钙、铜、锰、锌、钾等微量元素，经常食用，对人体健康十分有益，具有生津止渴、和胃降逆、健脾润肺等保健效果[1,2]。

苹果醋是苹果汁经发酵后得到的一种保健型饮品，不仅具有苹果的营养，而且具有降低胆固醇、消除疲劳、抗衰老等功效。本文以陕西富士苹果为原材料，通过酒精发酵、醋酸发酵等工艺，酿造全发酵型苹果醋，对其生产工艺进行了研究[3-5]，并通过单因素实验和正交实验对其调配工艺进行了优化[6]，确定了全发酵型苹果醋的最佳配方，为全发酵型苹果醋的工业化生产提供了理论指导，具有一定的应用前景。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

苹果：超市售卖的新鲜富士苹果，产于中国陕西； 精制白砂糖：广州市华侨糖厂；复合果胶酶：活力单位10 U/mg，山东汇益生物科技有限公司；酿酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌：山东沂源康源生物科技有限公司；柠檬酸：广州市晨炜化工有限公司；偏重亚硫酸钠：苏州君世化工科技有限公司；氢氧化钠：青县万江化工销售有限公司；碳酸氢钠：河南金大地化工有限责任公司；浓缩苹果汁：中国汇源果汁集团有限公司；蜂蜜：宝生园养蜂场有限公司。

1.2 实验仪器

精密电子天平 上海方瑞仪器有限公司；pH酸度计 上海蓝尼诗尔商贸有限公司；电热恒温水浴锅 厦门海铂特生物科技有限公司；多功能榨汁机 九阳电器制造有限公司；手持糖量计 上海勃基仪器仪表有限公司；生化培养箱 杭州科晓化工仪器设备有限公司；广口瓶、液封管、玻璃棒、酒精温度计、滴定管、烧杯、纱布、量筒、滤纸、胶头滴管、三角漏斗、水果刀。

1.3 测定方法

温度的测定：采用温度计测定；pH的测定：采用pH计测定；糖度的测定：采用糖量计测定；总酸度的测定：采用0.1 mol/L氢氧化钠滴定测定。

1.4 全发酵型苹果醋酿造的工艺流程

1.5 操作方法[7,8]

1.5.1 原材料的选取

挑选成熟的外观饱满且表面无烂的新鲜富士苹果，先用清水洗净，然后用水果刀去核切成小块待用。

1.5.2 榨汁去渣

将切成块状的苹果，放入榨汁机中进行榨汁，弃去果渣，只留下新鲜的果汁。

1.5.3 苹果汁的防褐变处理

因为苹果汁中含有大量的维生素C，果汁中的维生素C与空气直接接触，极容易被空气中的氧气氧化，而使果汁出现褐变现象，会影响后期苹果醋的风味与外观。而偏重亚硫酸钠具有很强的抗氧化功效，将偏重亚硫酸钠按1 L果汁中添加0.05 g的添加量加入到刚刚榨出的苹果汁中，并搅拌均匀，对苹果汁进行防褐变处理。

1.5.4 苹果汁的过滤

将榨出的新鲜苹果汁进行过滤处理，目的是为了过滤掉果汁中含有的少量植物纤维和果皮，先用4层纱布对苹果汁进行粗滤，然后取过滤后的滤液用8层纱布进行过滤，再用16层纱布过滤，最后用32层纱布过滤苹果汁得到相对澄清干净的苹果汁。

1.5.5 苹果汁的澄清

将复合果胶酶以每0.1 g/L苹果汁中添加量，加入到已经过滤好的苹果汁中，用玻璃棒搅拌均匀，将搅拌均匀后的苹果汁置于25 ℃环境下酶解2 h，以达到澄清苹果汁的目的。

1.5.6 调整糖度

为了使发酵能够顺利进行，使酿造出来的苹果醋风味更佳，根据成品苹果醋的要求，过滤澄清后的苹果汁需要进行调糖处理，已知17 g/L的糖产生1%的酒，发酵果醋前期需要果酒乙醇含量为8%～10%，果汁质量为W(kg)，则：

果汁的潜在酒精度α=果汁糖度(g/L)/17；

加糖量(kg)=(9-α)×0.017×W×100%。

1.5.7 调整酸度

发酵所用的酿酒高活性酵母菌最适宜生长的pH值为4.0～4.5，实验中苹果汁的pH值在3.0左右，本实验使用向苹果汁中添加碳酸氢钠的方法，调整苹果汁的pH值至4.0，使其达到酵母菌发酵的最适pH。

1.5.8 酵母菌的活化

称取少量酵母菌于小烧杯中，加入适量的温水(25～30 ℃)，用玻璃棒不断搅拌均匀，放置在30 ℃的恒温水浴锅中30 min，使酵母菌活化。

1.5.9 醋酸菌的活化

称取少量醋酸菌放入烧杯中，加入适量的温水(30～35 ℃)，用玻璃棒不断搅拌均匀，放置在35 ℃的恒温水浴锅中30 min，使醋酸菌活化。

1.5.10 酒精发酵

向苹果汁中加入经过活化处理的酿酒高活性酵母菌，然后置于32 ℃条件下进行发酵，每隔12 h检测1次发酵液的糖度和酒精度，并进行记录，直到各数据保持相对稳定为止。

苹果汁中的糖在无氧环境中通过酵母菌的作用，产生酒精和二氧化碳，此过程中的化学反应可简单表示为：C6H12O6+2ADP+2Pi→2C2H5OH+2CO2。

1.5.11 醋酸发酵

醋酸杆菌经过活化处理后，加入已经完成酒精发酵的发酵液中，进行下一步的醋酸发酵，发酵期间每隔24 h检测1次发酵液的醋酸含量，并进行记录，直到醋酸含量保持相对稳定为止。

酒精在有氧条件下，会被醋酸菌氧化成醋酸。醋酸发酵过程的化学反应可简单地表示为：C2H5OH+O2→CH3COOH+H2O。

1.5.12 醋酸含量的测定

醋酸的量(g/100 g)=(V1-V2)C/M×6%×100。

式中：V1-V2为消耗标准NaOH的量，mL；C为标准NaOH溶液的浓度，mol/L；M为样品质量或体积，本次实验为每次取10 mL；6%是换算系数。

1.5.13 过滤

待发酵结束后，对苹果醋进行过滤，去除其中含有的杂质成分，得到澄清的苹果醋。

1.5.14 杀菌

将过滤后的苹果醋置于70～85 ℃下保持20 min，进行杀菌。

1.5.15 调配及感官评定

为了使苹果醋具有更好的口感和风味，添加适量浓缩苹果汁、白砂糖、蜂蜜进行调味处理。

1.6 全发酵型苹果醋调配的正交实验

在前期单因素实验的基础上，选取不同酸度、不同糖度、浓缩苹果汁添加量、蜂蜜添加量4个单因素，以感官评定得分为指标，进行L9(34)正交实验(见表1)，得到全发酵型苹果醋调配的最佳配方。

表1 正交实验的因素和水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test %

2 结果与分析

2.1 全发酵型苹果酒的酒精发酵

在苹果汁中按0.12 g酵母/100 g果汁加入酵母菌，然后将其置于32 ℃条件下进行酵母菌的厌氧发酵，每隔12 h测1次糖度和酒精度，在发酵之前测定苹果汁的初始糖度为26%，初始pH为4.0，发酵过程中测定的糖度和酒精度的变化情况见表2。

表2 全发酵型苹果酒酒精发酵期间糖度和酒精度的变化Table 2 Changes of sugar and alcohol content during alcohol fermentation of full-fermented apple wine

图1 全发酵型苹果酒酒精发酵过程中糖度、酒精度的变化曲线Fig.1 Change curves of sugar and alcohol content during alcohol fermentation of full-fermented apple wine

由图1可知，在发酵前期的12 h内，糖度呈现急剧下降的趋势，酒精度呈现急速上升的趋势。由此可知在此期间酵母菌活动十分剧烈，在发酵环境中进行了大量的繁殖，与周围的氧气和营养物质进行着积极的反应，但是这段期间氧气比较充足，主要用于酵母自身的生长繁殖，发酵作用不强。发酵12～36 h期间，由于前期酵母菌自身的呼吸作用消耗了大部分的氧气和营养物质，导致此时发酵液中的氧气不足，发酵液中大量的酵母菌在近似无氧的环境下进行发酵产出大量酒精和二氧化碳，可以看到发酵液中有大量的气泡冒出来；当发酵进行到36～60 h时，由于发酵液中的营养物质基本被消耗完，此时发酵作用受到了抑制，因此酒精度上升的速度也相当缓慢，趋近于平缓，60 h后酵母菌的发酵基本终止。

由表2和图1可知，苹果酒的酒精发酵从发酵开始到结束大约为60 h，最后经测定，苹果酒酒精度为9.29%，残余糖含量为10.2%。

2.2 全发酵型苹果醋的醋酸发酵

在苹果酒中按10 g醋酸菌/100 g果酒加入醋酸菌[9,10]，然后将其置于35 ℃条件下进行醋酸菌的有氧发酵，每隔24 h测1次酸度和酒精度，发酵之前苹果酒酒精度为9.29%，发酵过程中测定的酸度和酒精度的变化情况见表3。

表3 全发酵型苹果醋醋酸发酵期间酸度和酒精度的变化Table 3 Changes of acidity and alcohol content during acetic acid fermentation of full-fermented apple vinegar

图2 全发酵型苹果醋醋酸发酵过程中酒精度、酸度的变化曲线Fig.2 Change curves of alcohol content and acidity during acetic acid fermentation of full-fermented apple vinegar

由图2可知，在发酵的前2 d，酒精度变化的趋势不是十分明显，这是因为发酵液中的醋酸菌正处于适应期，不能立即进行增殖，醋酸菌的含量基本保持不变；发酵时间为2～5 d时，酒精度的含量呈急剧下降趋势，得知在此阶段醋酸菌正在活跃地发酵，积极地把酒精转化为醋酸；发酵进行到5～6 d时，发酵液中的酒精几乎消耗完全，再没有多余的酒精转化成醋酸，从而导致发酵液的酸度和酒精度再无明显的变化，此时发酵液中的醋酸菌基本停止发酵。

由以上分析可知，苹果醋的醋酸发酵从发酵开始到结束大约为6 d，最后经测定，苹果醋总酸度为7.22%。

2.3 全发酵型苹果醋的感官评定

为了使苹果醋具有更好的口感，添加适量苹果汁、冰糖、蜂蜜进行调味处理后，从外观色泽、气味、滋味、体态几个方面对苹果醋进行感官评定，以打分的方式来辨别最好的样品[11,12]。

将制好的苹果醋经过滤、杀菌后装配静置1 d左右，直到果醋中所含有的悬浮物基本沉降完全后再进行相关的感官评定。

将要进行感官评定的全发酵型苹果醋样品，依次进行编号，依据表4的感官评判标准要求，对苹果醋从色泽、香气、口味、体态等方面进行感官评定并打分，对得分最高的样品进行以下实验。

感官评定分别以外观色泽(占20分)、香味(占20分)、味道(占30分)和体态(占30分)进行打分，满分为100分，评分细则和结果见表4。

表4 苹果醋感官评定标准Table 4 Sensory evaluation standards of apple vinegar

2.3.1 不同酸度全发酵型苹果醋感官评定的比较

因为不同的酸度对酿造出的全发酵型苹果醋的品质和口感有很大影响，为了使酿制的苹果醋具备更好的品质和风味，将酿造出的苹果醋的酸度分别调整为2%、3%、4%、5%、6%、7%，然后依据感官评定的标准，进行感官评定并打分，评分结果见表5。

表5 不同酸度全发酵型苹果醋感官评定结果Table 5 Sensory evaluation results of full-fermented apple vinegar with different acidity

通过对不同酸度全发酵型苹果醋的色泽、香味、味道、体态的感官评定评分可知，酸度为3%的苹果醋的评分最高，为97分，口感最佳，因此选择酸度为3%的苹果醋进行后面的实验。

2.3.2 不同糖度全发酵型苹果醋感官评定的比较

因为不同的糖度对酿造出的全发酵型苹果醋的口感有很大影响，为了使酿制的苹果醋具备更好的品质和风味，对酸度为5%的苹果醋通过添加食用冰糖的方法调整出糖度为5%、6%、7%、8%、9%、10%的苹果醋，然后依据感官评定标准，进行感官评定并打分，评分结果见表6。

表6 不同糖度全发酵型苹果醋感官评定结果Table 6 Sensory evaluation results of full-fermented apple vinegar with different sugar content

通过对不同糖度全发酵型苹果醋的色泽、香味、味道、体态的感官评定评分可知，糖度为8%的苹果醋的评分最高，为98分，口感最佳，因此选择糖度为8%的苹果醋进行后面的实验。

2.3.3 不同浓缩苹果汁添加量全发酵型苹果醋感官评定的比较

浓缩苹果汁是一种苹果醋加工中常用的调味剂，苹果醋中添加适量的浓缩苹果汁，可以改善苹果醋的风味，提高苹果醋的感官品质，对酸度为5%、糖度为8%的苹果醋通过添加7%、8%、9%、10%、11%、12%的浓缩苹果汁，然后依据感官评定标准，进行感官评定并打分，评分结果见表7。

表7 不同浓缩苹果汁添加量全发酵型苹果醋感官评定结果Table 7 Sensory evaluation results of full-fermented apple vinegar with different concentrated apple juice

通过对不同浓缩苹果汁添加量全发酵型苹果醋的色泽、香气、味道、体态的感官评定评分可知，添加量为10%的苹果醋的评分最高，为96分，口感和风味最佳。

2.3.4 不同蜂蜜添加量全发酵型苹果醋感官评定的比较

蜂蜜是一种纯天然的含有丰富营养成分的调味剂，苹果醋中添加适量的蜂蜜，不仅可以改善苹果醋的风味，而且还可以起到辅助澄清苹果醋的作用，进一步增强苹果醋的风味和感官质量，对酸度为5%、糖度为8%的苹果醋通过添加1%、2%、3%、4%、5%、6%的蜂蜜，然后依据感官评定标准，进行感官评定并打分，评分结果见表8。

表8 不同蜂蜜添加量全发酵型苹果醋感官评定结果Table 8 Sensory evaluation results of full-fermented apple vinegar with different additive amount of honey

通过对不同蜂蜜添加量全发酵型苹果醋的色泽、香气、味道、体态的感官评定评分可知，添加量为2%的苹果醋的评分最高，为98分，口感和风味最佳。

2.3.5 全发酵型苹果醋调配的正交实验结果

由表9可知，影响全发酵型苹果醋感官评分的主次为：A>C>D>B，即苹果醋酸度>浓缩苹果汁添加量>蜂蜜添加量>苹果醋糖度。所以全发酵型苹果醋调配的最佳配方组合为 A1B2C3D2，即苹果醋酸度为2%，糖度为8%，浓缩苹果汁添加量为11%，蜂蜜添加量为2%，此时全发酵型苹果醋的口感和风味最佳。

表9 正交实验结果Table 9 The results of orthogonal test

3 小结

本文采用全发酵工艺生产苹果醋，将新鲜苹果榨汁后进行酒精发酵和醋酸发酵，制得的苹果醋成品呈现出良好的淡黄色，并伴有苹果浓郁的香气，酸甜爽口，最后制得的全发酵型苹果醋酸度为7.22%，糖度为10.2%，通过对不同酸度、糖度、浓缩苹果汁、蜂蜜添加量全发酵型苹果醋的感官评定单因素实验和正交实验，最终确定全发酵型苹果醋的最佳配方为苹果醋酸度2%、糖度8%、浓缩苹果汁添加量11%、蜂蜜添加量2%，此时口感和风味最佳，为全发酵型苹果醋的工业化生产提供了理论指导。