陆炀, 颜云荞, 崔桂友*

(1.扬州大学 旅游烹饪学院，江苏 扬州 225127；2.无锡国通环境检测技术有限公司，江苏 无锡 214101)

食品指纹图谱从整体上研究食品物质体系，是一种较为复杂的技术。其特点是利用指纹图谱的特异性有效鉴别食品产地或真假，主要用于评价样品的真实性、优良性和稳定性。气相色谱-质谱法的指纹图谱是建立在用气体作为流动相色谱分离并定量与用质谱定性相联用的分析方法。通过对质谱库的比对分析及指纹图谱相似度的计算得出重现性好、高效、有代表的样品指纹图谱。而指纹图谱相似度的计算是基于对大量色谱数据进行化学计量学方法处理的。化学计量学是一门新兴的化学分支科学，运用数学、统计学、计算机科学以及其他相关学科的理论和方法，优化化学量测过程，并通过解析化学测量数据以最大限度地获取化学及相关信息[1]。所以，可以对大量常规相似的数据高效地辨识，从而进行定性、定量和质量控制，解决了人工感官检测所引起的抽象和主观问题。

1 材料与方法

1.1 试验材料

扬州盐水鹅:购于扬州市邗江区黄珏镇某摊位。采样时间上午11∶00，鹅肉称重后由摊主切成符合食用要求的薄块，并装入聚乙烯塑料袋中(摊主提供)。另取一袋倒入适量卤汁备检。掺兑实验所用掺兑样为风鹅，购于扬州欧尚超市，厂家为扬州市雾中花食品工贸有限公司。

1.2 试验设备

料理机 山东九阳小家电有限公司；SPEM手动进样手柄、100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)萃取头、75 μm CAR/PDMS萃取头、50/30 μm DVB/CAR-PDMS萃取头 上海安谱科学仪器有限公司；DSQ Ⅱ型气相色谱-质谱联用仪(GC-MS) 美国赛默飞世尔科技公司；DK-S26型电热恒温水浴锅 上海申生生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

试验材料为扬州盐水鹅(8个批次，编号为1～8)。鹅肉用料理机绞碎，取4 g放入15 mL样品萃取瓶中，盖上盖子，冷藏待用。卤水取定量直接分装至15 mL样品萃取瓶中，盖上盖子，冷藏待用。

将萃取头在气相色谱的进样口老化，老化温度为250 ℃，载气体积流量为0.8 mL/min，分流比为50∶1，老化时间为2 h。

利用手动进样手柄将固相微萃取器的萃取头插入到样品瓶中，恒温45 ℃，推出萃取头。吸附40 min，随后拔出于气相色谱仪进样。250 ℃解析2 min，同时启动仪器采集数据。

1.3.2 仪器测定条件[2]

气相色谱条件：毛细血管柱为DB-5MS柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，载气为He，流速为0.8 mL/min，不分流，恒压35 kPa，进样温度250 ℃，接口温度250 ℃，起始温度40 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升温至130 ℃，无保留；再以8 ℃/min升温至200 ℃，无保留；再以12 ℃/min升温至250 ℃，保留15 min。

质谱条件：EI，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，接口温度280 ℃，质谱质量扫描范围33～500 amu。

1.3.3 掺兑实验

取部分待测9号盐水鹅样品进行掺兑实验，分别掺比风鹅样品0%、25%、50%、75%(质量分数)，编号为C1、C2、C3、C4。

1.3.4 定性方法

定性：化合物经计算机检索同时与NIST Library(107 k compounds)和Wiley Library(320 k compounds)相匹配。仅报道匹配度和纯度大于800(最大值1000)的鉴定结果。

2 结果与讨论

2.1 色谱峰的匹配

本试验选用内标法对扬州盐水鹅中的风味物质进行定量分析，在样品中添加2-乙酰基吡啶(GR级)，通过组分与内标峰的面积比，对组分进行定量，该方法减少了手动进样误差对定量结果的影响。在相同试验条件下测定2-乙酰基吡啶，其保留时间约为11.98 min，其出峰位置、峰形、分离度和稳定性均比较好；扬州盐水鹅风味物质主要是碳氢氧成分，所以内标物2-乙酰基吡啶与分析目标成分有类似的化学性质，对风味组分定量效果较好；且样品在该处没有色谱峰，可以作为试验的内标参考峰。以此参考峰求出其他所有色谱峰的相对保留时间α。以2-乙酰基吡啶出峰时间为标准，对各峰进行定位匹配。

计算公式：α=tri/trs。

式中：tri为待测峰的绝对保留时间；trs为内标参考峰的绝对保留时间。

2.2 指纹图谱的建立与分析

对1～8号样品进行测定，从中选取了9个共有峰作为可以构成扬州盐水鹅风味指纹图谱的特征指纹峰。特征指纹峰的峰面积占总峰面积的35%以上，值得注意的是部分色谱图中乙醇含量很高，相对峰面积超过50%，这可能是由于扬州盐水鹅在制作过程中添加的料酒量不同导致检测数值不同，所以乙醇不能作为共有峰成为特征指纹峰。以数字编号的峰为扬州盐水鹅的指纹峰见图1，S为内标物2-乙酰基吡啶所出峰，并据此求出每一个标样特征峰的相对峰面积Sr值。以2-乙酰基吡啶的峰面积为标准，对各峰进行定量匹配。

图1 扬州盐水鹅标准样品指纹图谱Fig.1 Fingerprint of standard samples of Yangzhou salted goose

注：1～9号峰分别为己醛、C16H18NO2、己酸乙烯基酯、辛醛、芳樟醇、壬醛、癸醛、4-烯丙基苯甲醚、C10H12O2，S为2-乙酰基吡啶所出峰。

计算公式：Sr=Ai/As×100%。式中：Ai为特征峰的面积；As为内标参考峰的面积。

将样品中的各组分的相对保留值α按从小到大的顺序排列，找出共有特征峰的α值从小到大排列，得到表1。计算可得共有特征峰对应的Sr值，见表2。由此可建立起扬州盐水鹅风味指纹图谱，见图1。

表1 1～8号样品指纹图谱中α值Table 1 The α values in fingerprint of 1～8 samples

表2 1～8号样品指纹图谱中Sr值Table 2 The Sr values in fingerprint of 1～8 samples

由表1和表2可知，扬州盐水鹅的主要风味成分为碳氢氧成分，其以醛类居多，醛类物质阈值低且在酱腌肉中含量较高，是酱腌肉风味形成极其重要的一类化合物。肉品挥发性风味成分中的醛来源于脂肪氧化，其中辛醛(油脂清新气息)和壬醛(脂肪香气)是油酸氧化的产物[3]，己醛(清新香草香气)是亚油酸的主要氧化产物[4]，其次还有醇类及杂环化合物类。含N的杂环化合物是对肉类风味起主要作用的化合物之一，而醚类化合物也是重要的风味物质，特别是含有苯环的醚，大多数具有强烈而愉快的香气。本实验检测的4-烯丙基苯甲醚很可能与所加香辛料八角茴香、大茴香等有关。

2.3 精确性实验

对3号标样连续进行10次，按1.3.1操作及1.3.2仪器测定条件进行分析，其特征峰的相对保留时间α值和特征峰的相对峰面积Sr值见表3和表4。

表3 精确性实验特征峰的相对保留时间α值Table 3 The relative retention time α values of characteristic peaks in accuracy experiments

续 表

表4 精确性实验特征峰的相对峰面积Sr值Table 4 The relative peak area Sr values of characteristic peaks in accuracy experiments

由表3和表4可知，扬州盐水鹅风味特征峰的相对保留时间α值的RSD均小于2%；且特征峰的相对峰面积Sr值的RSD也比较小，均低于3.5%。进一步表明顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱法检测精确性较高，与指纹图谱检测要求相符。

2.4 重复性实验

按1.3.1操作及1.3.2仪器测定条件进行分析，取1～5号样品分5次进行试验，共计5 d，其特征峰的相对保留时间α值和特征峰的相对峰面积Sr值见表5和表6。

表5 重复性实验特征峰的相对保留时间α值Table 5 The relative retention time α values of characteristic peaks in repetitive experiments

表6 重复性实验特征峰的相对峰面积Sr值Table 6 The relative peak area Sr values of characteristic peaks in repetitive experiments

由表5可知，扬州盐水鹅风味特征峰的相对保留时间α值的RSD值较小，均小于2%，说明顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱法检测特征峰的相对保留时间α值有较好的重复性。由表6可知，扬州盐水鹅风味特征峰的相对峰面积Sr值的RSD值在1%～23%的范围内，表明顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱法检测特征峰的相对峰面积Sr值的稳定性一般，这可能与顶空固相微萃取处理方法有关。

2.5 稳定性实验

取4号样品，分别在制备后1，4，8，12，24，48 h进样，其特征峰相对保留时间α值和相对峰面积的Sr值见表7和表8。

表7 稳定性实验特征峰的相对保留时间α值Table 7 The relative retention time α values of characteristic peaks in stability experiments

表8 稳定性实验特征峰的相对峰面积Sr值Table 8 The relative peak area Sr values of characteristic peaks in stability experiments

由表7和表8可知，扬州盐水鹅的特征峰的相对保留时间α值的RSD值均小于2.5%，而相对峰面积Sr值的RSD值也比较小，均小于8.5%。表明顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱法检测扬州盐水鹅风味挥发性成分在48 h内稳定性较好，与指纹图谱检测要求相符。

2.6 色谱指纹图谱相似度计算与分析

指纹图谱的特异性，能有效鉴别食品样品的真伪或产地，评价样品的真实性、优良性和稳定性。通过制定指纹图谱，使特征峰的含量和比例可以达到控制食品质量和确保食品质量相对稳定的目的。而指纹图谱相似度正是一种评价指纹图谱稳定性与均一性的重要指标。指纹图谱相似度主要是分析指纹图谱，强调准确的辨识而非精密的计算。宏观上对特征进行分析，重点在于辨认图谱整体面貌，而不是追求细枝末节[5]。

目前可查阅的关于研究指纹图谱相似度的文献较少，洪筱坤等人[6]研究指出色谱指纹图谱的相似度需要从整体上考虑，单纯引入N强峰、重叠率等量化数据分析图谱间的相似程度，难以全面判断指纹图谱质量。倪力军等人[7]用相关系数和距离系数仅对红外指纹图谱间相似度进行量化评价和比较，其判断过程和结果也存在一定的主观性。

相似度的评价方法主要包括以下三种类型：一是利用指纹图谱间的差异性评价，如距离系数法；二是利用指纹图谱间的相似性评价，如夹角余弦法；三是利用相似性与差异性的结合来评价，如改进的Nei系数法。改进的Nei综合了色谱指纹图谱的总色谱峰、保留时间、峰面积(或峰高)等多重信息，能够比较全面地判断指纹图谱的综合信息，所以又称为综合信息指数[8]。但是由于本试验采取的前处理方法为顶空固相微萃取，由于手动操作的原因，样品风味成分的保留时间有所偏差，导致综合信息指数波动较大，无法准确全面地判断扬州盐水鹅的风味指纹图谱。所以，本文主要选择前两种评价方法综合评价扬州盐水鹅指纹图谱相似度及差异性。

2.6.1 欧氏距离[9]

欧氏距离是距离测度中使用最广泛的一种，公式为：

式中：Xik代表第i个样品第k个特征变量，Xrk代表共有模式均值向量第k 个特征变量(k=1，2，3……m)。欧氏距离在量上反映的是指纹图谱间的距离和化学成分含量的差异，侧重于特征变量值的大小亲疏程度的相似性。但是该系数没有考虑到各指纹峰的相关性和方差的差异性问题，所以存在一定的局限性。

2.6.2 夹角余弦系数[10]

夹角余弦系数是指纹图谱特征变量在变化模式上的相似性测度，源于几何学中相似形和多维空间向量夹角的理论，其公式为：

式中：Xik代表第i个样品第k个特征变量, Xrk代表共有模式均值向量第k个特征变量(k=1，2，3……m)。夹角余弦系数从质上判断样品与标准图谱之间的相似性，从而识别化学组成在含量比例上的相似性。

2.6.3 皮尔逊相关系数

在指纹图谱中以相关系数测度的相似度为：

2.6.4 综合评价

表9 1～8号扬州盐水鹅样品的相似度Table 9 Similarity of Yangzhou salted goose 1～8 samples %

由表9可知，8个批次的扬州盐水鹅样品的风味指纹图谱相似度较高。样品的欧式距离范围在3.88%～7.10%，夹角余弦值99.98%以上，相关系数值大于93.88%。有研究表明，欧式距离可以比较好地检测各指纹图谱间谱峰总面积的波动情况[11]。而相关系数或者夹角余弦对检测色谱峰比值的差异性灵敏度较高。以上评价指标都可以用来评价扬州盐水鹅的风味质量。

2.6.5 待测样品与掺兑样品的判定

以上实验是根据8个批次的扬州盐水鹅标准品建立指纹图谱，现对9号样品分析。对待测样品按1.3.3操作及以上3种算法计算相似度，结果见表10。

表10 掺兑实验结果Table 10 The results of blending experiment

由表10可知，9号样品在不含掺兑的情况下，各项指标包括欧式距离、夹角余弦和相关系数都在标准指纹图谱的相似度判定的标准范围之内。由此判断该待测样品合格。掺兑后样品的各个相似度的变化都较为明显，随着掺兑含量的升高，样品的相似度逐渐变小，说明产品质量发生很大波动。综上，指纹图谱技术对扬州盐水鹅的风味评价具有重要意义，可以有效监控扬州盐水鹅的质量。

3 结论

本试验主要探究了扬州盐水鹅指纹图谱的建立及指纹图谱相似度的计算。通过对8个批次的扬州盐水鹅进行检测分析，利用欧式距离、夹角余弦法及相关系数法等化学计量方法进行相似度的计，算确定了以9种特征风味物质为基础的指纹图谱。由此构建的指纹图谱有较强的特征性及唯一性，既能起到鉴别真伪的效果，又能起到监控质量的稳定性。缺点是由于本试验的前处理方法是顶空固相微萃取，处理方法虽简单方便，但是手动进样会影响风味成分的保留时间，图谱没有溶剂进样稳定。所以今后的研究重点是寻找更适合的实验方法，将指纹图谱的所有特征信息有机地结合起来，建立一个全面的扬州盐水鹅指纹图谱，为评定扬州盐水鹅的风味品质提供新的判断思路，改变传统的依靠感官评价的单一方法。