赵万里 詹世钦 陈江生 马文斌 李旭 覃波

518105广东省深圳市宝安区松岗人民医院，广东深圳

创伤性脑损伤包括原发脑损伤与继发性脑损伤，是造成45岁以下成年人群死亡的主要原因之一，目前临床中并无有效治疗药物，给患者家庭和社会造成了沉重负担[1]。已有研究指出[2]，氧化应激反应是造成继发性脑损伤的主要病理机制，氧自由基损伤是影响创伤性脑损伤预后的重要影响因素之一。葛根素为天然多酚类化合物，结构与雌二醇相似，具有部分雌激素样作用，作为天然抗氧化剂，可抑制脂质过氧化，清除各种氧自由基，保护细胞膜结构，具有降血压、抗氧化、抗癌等多种药理活性。在多种疾病模型中，葛根素能够有效清除氧自由基，发挥抗氧化作用，有研究指出，其对老年性痴呆、缺血性脑卒中、缺血再灌注损伤等中枢神经系统疾病具有神经保护作用，但在创伤性脑损伤大鼠研究中的应用研究较少[3-4]。本研究对葛根素、对创伤性脑损伤大鼠抗凋亡影响的机制进行了分析，以期能为后期临床研究深入和临床治疗提供指导和参考。

资料与方法

选择健康成年雄性SD大鼠60只，体重250～300 g，构建TBI模型；随机分为TBI组、假手术组和TBI给药组(葛根素治疗)，每组各20只。

方法：①TBI组：采用颅脑损伤撞击器(型号：Benchmark TM)制作TBI模型，大鼠禁食12 h后在其腹腔内注入50 mg/kg 2%戊巴比妥麻醉，麻醉后将其俯卧固定于支架处，剥离骨膜将右顶骨暴露出来。于矢状缝中线旁开2.5 mm，在冠状缝和人字缝之间钻5 mm直径骨孔，使硬脑膜暴露出来。将电磁颅脑损伤撞击器的传动装置安装在脑立体定位仪上，使撞击头末端与硬脑膜垂直。设置撞击器，以3 m/s速度用5 mm直径的撞击头制作中度TBI，打击时间为120 ms，打击深度为2 mm。制作模型后立即移除撞击器并缝合头皮切口。大鼠恢复自主呼吸后重新进入饲养笼，进行损伤后观察。②假手术组：步骤同上，但无冲击损伤过程。③给药组：制作模型15 min后，腹腔内注射60 mg/kg葛根素。

观察指标：通过采用改良神经功能缺损评分(mNSS)评价神经功能，脑组织干湿重称量法评价脑水肿，TUNEL染色评价脑损伤体积和神经元的凋亡，用酶活试剂盒检测损伤48 h后抗氧化酶超氧化物歧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的活性以及氧化应激产物丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)和一氧化氮(NO)的水平，最后使用Westernblot法检测Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2的表达水平。①mNSS评分：量表包括自发运动、运动对称性、提尾时双前肢对称性、攀爬能力、触须反应、惊吓反应，依据大鼠行为能力对每个测试项目给予0～3分评分，总分为3～18分。②制备脑组织冰冻切片：向麻醉后小鼠左心室灌注大量冰生理盐水，肝脏发白后再灌注少量浓度为4%聚甲醛，小鼠全身肌肉僵直后将其头颅离断并取出脑组织，浸泡并脱水处理，转入CT胶包内行包埋预处理后置于恒温箱处理切片，置于-80℃冰箱内备用。③TUNEL染色：依据试剂盒标准步骤行TUNEL染色，400倍显微镜下拍照并观察，细胞核染上棕黄色颗粒为TUNEL阳性细胞，计算凋亡细胞数目。④抗氧化酶活性以及氧化应激产物测定：取出大鼠脑组织，测量GSSG、SOD、GSH、CAT、NO、MDA水平。⑤Westernblot法：取损伤边缘区域的脑组织，提取总蛋白，Bradford法测定蛋白水平，分离样品，电泳，常规转膜，封闭；5%BSA稀释一抗(兔抗Nrf-2单克隆抗体)，4℃孵育过夜；第2天用TBST进行洗膜，将膜浸入二抗稀释液(1：10 000)中，室温孵育2 h；TBST进行洗膜后加入ECL发光试剂，暗室进行曝光，显色，Image J软件用于数据分析。

统计学方法：数据采用SPSS23.0软件分析；计量资料以(±s)表示，采用t检验；(P＜0.05)为差异有统计学意义。

表1 各组大鼠脑组织MDA、CAT、SOD和GSH含量比较(±s)

表1 各组大鼠脑组织MDA、CAT、SOD和GSH含量比较(±s)

组别 n GSSG NOμmol/(g·pro) SOD(U/mg) GSH(U/mg) MDA(nmol/mg) CAT(U/mg)TBI组 20 1.02±0.21 3.76±0.33 4.67±1.13 15.34±1.52 39.78±2.67 49.24±5.55假手术组 20 1.45±0.09 1.05±0.09 16.12±0.98 33.57±1.20 17.29±2.10 165.33±5.44 TBI给药组 20 2.67±0.28 1.65±0.13 9.40±0.81 24.97±1.65 23.25±1.90 116.44±5.97 F 2.495 2.767 1.996 2.517 2.389 2.279 P 0.023 0.008 0.047 0.019 0.032 0.037

结 果

各组大鼠脑组织MDA、CAT、SOD和GSH含量比较：TBI给药组大鼠脑组织GSSG、SOD、GSH、CAT水平均高于TBI组，NO、MDA水平均低于TBI组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

各组大鼠TBI神经细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达比较：TBI给药组大鼠脑组织Bcl-2水平高于TBI组，Bax/Bcl-2及凋亡细胞数低于TBI组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

脑水肿与mNSS评分比较：TBI给药组大鼠脑组织块重于TBI组，mNSS评分低于TBI组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

讨 论

脑损伤后神经元细胞在多种因素作用下会发生凋亡，具体机制十分复杂，但已有大量动物实验和临床研究指出，TBI后PI3K/AKT通路与细胞凋亡密切相关，且与细胞生存有相关性[5]。因此临床中可通过激活PI3K/AKT通路，调节脑缺血后氧化应激反应，抑制细胞凋亡和炎症反应。目前临床中已有研究指出，葛根素可有效缓解创伤性脑损伤所造成的氧化应激损伤，但尚未明确其具体机制，部分学者认为TBI所引起的神经功能方面的障碍与细胞破损、神经细胞凋亡存在相关性，因此我们猜测葛根素可影响PI3K/AKT通路，进而发挥抗氧化应激和抗细胞凋亡的作用[6-7]。本研究就葛根素对创伤性脑损伤大鼠抗凋亡影响的机制进行了探究。

目前临床中葛根素主要应用于对缺血性脑卒中、老年性痴呆、再灌注损伤等疾病的治疗，鲜有对于创伤性脑损伤的研究。曹建忠等人在就葛根素对全脑缺血再灌注损伤的神经保护作用进行探究[8]，结果显示葛根素治疗组再灌注后各个时间点的Bcl-2蛋白表达增加，Bax蛋白表达降低。由于葛根素为植物雌激素，主要成分为异黄酮，Lepar等人在研究中指出食物中植物雌激素分子可经血脑屏障进入大脑[9]，异黄酮对小脑及额叶皮层区内富含的ER-β具有较高的亲和力，与其结合后发挥雌激素作用。葛根素可调节Bcl-2家族相关蛋白表达，增强Bcl-2蛋白免疫强度，进而缓解缺血缺氧性脑损伤，并发挥抗氧化作用，清除自由基，扩张脑血管，增加脑血流量，进而抑制神经细胞凋亡[10]。有研究指出，葛根素可显著降低eNOS蛋白和基因的表达，缓解氧化应激损伤和心肌缺血性损伤，这一作用是通过PI3K/AKT信号通路介导，且其能够通过cGMP和cAMP信号通路减轻钙离子内流，发挥抗血管收缩作用，抑制神经细胞凋亡[11]。

表2 各组大鼠TBI神经细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达比较(±s)

表2 各组大鼠TBI神经细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达比较(±s)

组别 n Bcl-2 Bax Bax/Bcl-2 凋亡细胞数TBI组 20 9.80±1.64 10.24±2.05 1.07±0.31 13.64±2.55假手术组 20 3.94±1.33 5.90±1.02 1.63±0.65 1.90±0.43 TBI给药组 20 11.74±2.11 10.18±3.12 0.84±0.17 10.68±2.46 F 2.456 1.827 2.524 3.098 P 0.028 0.076 0.018 0.002

表3 脑水肿与mNSS评分比较(±s)

表3 脑水肿与mNSS评分比较(±s)

组别 n 脑组织块(g) mNSS评分(分)TBI组 20 0.068±0.05 15.44±3.25假手术组 20 0.171±0.08 7.68±2.13 TBI给药组 20 0.124±0.09 9.22±3.06 F 2.352 2.858 P 0.034 0.004

综上所述，葛根素可通过抑制氧化应激反应、减轻脑水肿、调节Bax/Bcl-2表达而发挥神经保护作用，进而抑制神经细胞凋亡。