刘晓虹 靳亚莉 周晓维

麻风是一种严重危害人类健康的慢性传染病，尽管从40年代起就开展了以氨苯砜类药物为主的化疗，但迄今为止仍有多数国家尚未能达到控制和消灭麻风。我国麻风发病趋势总体处于低流行状态，仍位于世界前位[1]。麻风杆菌(ML)是麻风的病原体，在人体内主要侵犯皮肤、黏膜、周围神经、淋巴结、网状内皮系统以及横纹肌等器官和组织。诸多研究表明其致病机制主要是由于机体对ML及其抗原成分发生的细胞和体液免疫反应的结果，麻风杆菌种属特异抗原酚糖脂I(PGL-I)，是麻风血清学检查使用最广的抗原；使用单克隆和多克隆抗体法分析PGL-I分子上的抗原表位，表明其上3,6-二甲氧基葡糖残基是重要的，并以此为基础将其上的天然三糖结构(Natural Trisaccharide)通过连接臂苯丙酰基(Phenolic)或辛基(Octyl)连接到小牛血清蛋白(BSA)上而产生半合成糖蛋白抗原： NT-P-BSA，NT-O-BSA[2]。Izumi等[3]曾用NT-O-BSA建立明胶颗粒凝集实验为现场应用。但其敏感性和特异性均较NT-P-BSA-IgM-ELISA低。本实验拟通过 NT-P-BSA-IgM-ELISA(NT-IgM-ELISA)和NT-P-BSA-IgG-ELISA(NT-IgG-ELISA)的比较实验，进一步评价两法的敏感性和特异性，以期建立更加优化的方法。

1 材料和方法

1.1 受检血清 麻风患者血清80份，来自于广西皮肤病研究所。据临床表现、细菌学、病理学和免疫学将麻风患者分为5型：结核样型(TT)、界限偏结核样型(BT)、中间界限型(BB)、界线类偏瘤型(BL)和瘤型(LL)。其中前两型称作少菌型(PB)30例，后三型称作多菌型(MB)50例。正常人血清80份,来自大连市体检中心，经检测为正常人血清。结缔组织疾病患者血清30份，银屑病患者血清30份，妊娠血清30份，结核病患者血清30份，分别来自大连市皮肤病医院、大连市妇产医院和大连市胸科医院。

1.2 抗原 NT-P-BSA抗原由日本奈良大学Fujiwara教授提供。用挥发性缓冲液将抗原配成浓度为0.1 ug/ml，按照每孔0.1 mL包被于96孔酶标板(Costar公司)，37℃ 18 h干燥后置4℃备用。

1.3 酶结合物和显色剂 羊抗人HRP-IgM(型号D110157)，羊抗人HRP-IgG(型号D110117)购自Sigma公司，显色剂为邻苯二胺(OPD)购自Promega公司。

1.4 实验方法 间接酶联免疫吸附试验(ELISA)。采用吴勤学教授最适化后的NT-P-BSA-ELISA[4]。其简要程序如下：用PBS(PH7.2)浸泡抗原包被96孔板(0.2 mL/孔)，37℃孵育20 min后倒去浸泡液，甩干，加入5%封闭液(SM-PBS)0.2 mL/孔，放置于37℃孵育2 h；甩干封闭液；加待检血清用2.5% SM-PBS稀释，每孔加0.1 mL，置于37℃孵育1 h；甩去血清，用PBS冲洗3遍扣干；加酶结合物按1∶1000稀释(稀释液为2.5% SM-PBS)，每孔0.1 mL，置37℃ 1 h；甩去酶结合物，用PBS冲洗3次。加0.01%底物液(OPD 10 mg，PH 5.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液99 mL，甲醇1 mL，30% H2O240 μL)，每孔0.1 mL，置37℃保温30 min；加终止液(1.25 M的H2SO4)，每孔0.1 mL，立即在酶标仪(Bio-RAD)于波长为490 nm处读OD值。每份血清加两个孔，取平均值，两孔值变化超过10%重复实验。每板均设阳性对照，阴性对照及空白对照，用空白对照校零点。

1.5 统计学方法 使用SPSS 22.0统计软件,计算平均值、标准差、t检验﹑敏感性和特异性，阳性预测值和阴性预测值， P/N比值(患者平均值/正常人平均值)，折线图。

2 结果

见表1。两组实验血清稀释度在1∶200时P/N值均较1∶100大，我们实验中选取血清的稀释浓度为1∶200。

麻风患者皮肤组织切刮液查菌是诊断麻风的主要方法之一，我们将血清学结果与查菌的细菌指数(BI)进行作图比较，结果见图1。

表1 NT -IgM-ELISA和NT-IgG-ELISA在血清浓度1∶200和1∶100时的实验结果

注：P/N=患者血清OD平均值/正常人血清OD平均值

表2 用NT-IgM-ELISA和NT-IgG-ELISA检测受检对象血清抗体的结果

注：PB=少菌型患者，MB=多菌型患者，Nu=例数，NT-IgM-ELISA中t=7.98，P<0.05，NT-IgG-ELISA中t=7.56，P<0.05

表3 麻风患者与正常人的阳性预测值和阴性预测值

图1 NT-P-BSA-IgM-ELISA中BI值与OD值的关系

从图1、2可知(1)随着细菌指数(BI)的增高，血清学检测OD值也增高；(2)在BI为0时，OD值在0.08～0.26之间；(3)相同的BI值，不同的OD值。说明血清学较查菌方法敏感，可以早期监测病情变化；(4)BI在0～2之间时，图1呈轻度上升趋势，图2曲线基本呈水平状，说明NT -IgM-ELISA较NT -IgG-ELISA敏感性稍高。

图2 NT-P-BSA-IgG-ELISA中BI值与OD值的关系

3 讨论

本次NT-P-BSA-ELISA进一步证实麻风患者血清中存在抗NT-P-BSA的IgM和IgG抗体，且两抗体检测均对诊断麻风有意义，NT-IgM-ELISA的敏感性稍高于NT-IgG-ELISA，在多菌型麻风患者的检出率较少菌型麻风患者检出率高。较查菌方法，部分查菌阴性(BI=0)的患者血清学检测为阳性，提示血清学方法可早期辅助诊断麻风。

妊娠个体，银屑病和结核病患者的血清中检测到了交叉抗NT-P-BSA的抗体，麻风杆菌和结核分枝杆菌同属于分枝杆菌属，有共同的种属基因片段，及多种不同的可引起机体免疫应答的分枝杆菌脂抗原，而麻风杆菌的抗原大约为结核杆菌的1/3[5]，这可能是产生交叉反应的主要原因。至于妊娠个体的交叉，有人报道可高达10.8%(即使常规输血者亦可高达10.6%)[6]，这可能是妊娠后机体机能的变化，产生某种与抗体结构相似的物质，这还有待进一步的研究。

多菌型麻风临床特征明显，实验室检测阳性率高，诊断通常不会出现障碍，少菌型麻风临床特征常不典型，皮肤切刮液查菌常为阴性，所以需要有高敏感性实验方法辅助诊断，以便早期发现，早期治疗。另外麻风是皮肤病中的超级“模仿者”，被误诊的病种较多，如银屑病、过敏性疾病、结缔组织病等[6]，需要特异性较高实验方法，用于鉴别诊断。

总之，NT-P-BSA-ELISA的敏感性和特异性均较高，可用于麻风的辅助诊断，治疗情况及治愈后复发的监测，其中NT-IgM-ELISA敏感性和特异性均较NT-IgG-ELISA高。