田 甜， 梁 霞， 韩翠欣， 陈咏梅， 王晓丹， 班 玲， 刘永权

河北省石家庄市第二医院产科，石家庄 050051

妊娠期高血压病(hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP)是一种临床常见的严重的妊娠期并发症，是造成孕产妇和围产儿死亡的重要原因，但是目前对于其发病原因与发病机制至今尚无明确定论。近年来，子宫及胎盘缺血、缺氧在HDCP发病中的作用已得到普遍认可[1-3]。相关研究[4-5]显示：IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素在HDCP相关的病理及生理过程中均发挥重要作用。因此，观察3种因子在不同严重程度HDCP患者胎盘组织中的表达及相互作用，可以为HDCP的发病机制及临床治疗及预防提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 入选2016年7月至2018年1月在石家庄市第二医院和河北省二院住院分娩的HDCP患者。临床诊断符合第7版《妇产科学》中妊娠期高血压病诊断标准与分类原则[6]。纳入120例符合诊断标准的为病例组，其中妊娠期高血压48例，轻度子痫前期40例，重度子痫前期32例，对照组为同期分娩的50例正常妊娠妇女的胎盘组织。两组研究对象均为单胎初产妇，既往无心脏病、肝肾疾病、糖尿病、高血压等病史，无其他妊娠期合并症、并发症，均无吸烟史，均于临产前接受剖腹产。其中病例组年龄20～35岁，平均(28.7±4.5)岁，妊娠周期35～40周，平均(37.5±2.3)周，孕期平均体质量(52.4±22.3) kg，平均身高(160.3±8.3) cm，对照组年龄20～35岁，平均(28.5±4.6)岁，妊娠周期35～40周，平均(37.7±2.4)周，孕期平均体质量(53.7±22.7) kg，平均身高(161.3±8.9) cm，两组一般资料差异无统计学意义。本研究通过医院伦理委员会审核批准。

1.2 主要试剂及仪器 兔抗人IGF-Ⅱ单克隆抗体、兔抗人IGFBP-1单克隆抗体购自武汉博士德公司；抵抗素兔抗人多克隆抗体购自北京博奥森生物科技有限公司；粘合剂(APES)、二氨基联苯胺(DAB)和SP9000 通用型试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠和氯化钾等化学试剂由北京益利化学有限公司生产。

1.3 样本采集与处理 剖宫产娩出胎盘后从母面中央采集1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm胎盘组织，注意避开出血坏死区与钙化区，然后用生理盐水冲洗干净后置于10%甲醛固定液中24 h以上，固定组织样本后进行常规石蜡包埋，取4 μm切片做免疫组化染色。

1.4 免疫组化染色 S-P法测定胎盘组织中IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素表达水平。将石蜡包埋切片进行常规脱蜡处理，并用梯度乙醇进行水化处理，然后进行抗原热修复处理，滴加3%H2O2消除内源性过氧化氢酶活性，PBS缓冲液冲洗，再用正常羊血清做封闭处理，滴加一抗(IGF-Ⅱ单克隆抗体、IGFBP-1单克隆抗体和抵抗素多克隆抗体，生物学效价为1∶50)置于4℃环境下孵育过夜，再用PBS缓冲液冲洗处理3次，滴加二抗(通用型SP9000 复合物)并置于37℃环境下孵育0.5 h，用PBS 冲洗处理2次，再滴加三抗(SP 复合物)后置于37℃环境下孵育0.5 h，用PBS缓冲液冲洗处理2次。最后做DAB/H2O2染色处理5 min，用生活用水反复冲洗，苏木精复染1 min，常规制作切片于显微镜下观察。

1.5 结果评定标准 镜下观察各样本免疫染色情况，胎盘滋养细胞内可见棕黄色沉着颗粒，且细胞结构清晰即视为阳性细胞反应，高倍镜下选择5个不同视野参考 Fromowitz 综合积分原则对各胎盘样本中IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素表达进行评分[7]。按照染色程度进行评分：与背景色相比，细胞内染色不清或无染色时计0分；细胞膜、细胞质内可见少量浅黄色，染色程度高于背景色时计1分；细胞膜、细胞质内可见较多黄色或棕黄色颗粒时计2分；细胞膜、细胞质内着色均匀，可见大量棕黄色或深棕黄色颗粒时计3分。按照阳性细胞表达百分比进行评分：无阳性细胞反应计0分；阳性细胞<25%计1分；25%<阳性细胞<50%计2分；>50%计3分。

将上述2项积分之和作为评估结果标准：0～1分即为(-)，2～3分即为(+)，4～5分即为()，5分以上即为()。(阳性+强阳性)÷各组患者例数×100%=阳性率。

1.6 统计学处理 采用SPSS17.0统计学软件包进行数据处理，计数资料以n(%)形式表达，组间统计学处理采用χ2检验，多个样本采用行×列卡方；IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素表达相关性分析采用Spearman相关性分析，检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 病例组和对照组IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素表达情况 结果(表1)表明：IGF-Ⅱ在对照组阳性表达率明显高于病例组(P<0.01)，IGFBP-1、抵抗素在对照组阳性表达率明显低于病例组(P<0.01)。

表1 病例组和对照组IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素表达情况 n(%)

2.2 病例组IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素表达情况 根据HDCP病情从轻到重的程度，将病例组分为妊娠期高血压、轻度子痫前期、重度子痫前期3组。结果(表2、图1～图3)表明：IGF-Ⅱ阳性表达率随病情加重逐渐降低，IGFBP-1和抵抗素阳性表达率随病情加重逐渐升高，重度子痫前期组IGFBP-1、抵抗素的阳性表达明显高于妊娠期高血压组，重度子痫前期组IGF-Ⅱ的阳性表达水平明显低于轻度子痫前期组和妊娠期高血压组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素表达相关性分析 抵抗素与IGFBP-1表达正相关(r=0.593 7，P<0.05)，与IGF-Ⅱ表达负相关(r=-0.678 5，P<0.05)，IGFBP-1与IGF-Ⅱ表达负相关(r=-0.677 4，P<0.05)。

表2 病例组内IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素表达情况 n(%)

*P<0.05与妊娠期高血压组相比，△P<0.05与轻度子痫前期相比

图1 IGF-Ⅱ在不同组内表达情况

A: IGF-Ⅱ在正常胎盘组织中的表达；B: IGF-Ⅱ在妊娠期高血压胎盘组织中的表达；C: IGF-Ⅱ在轻度子痫前期胎盘组织中的表达；D: IGF-Ⅱ在重度子痫前期胎盘组织中的表达. Original magnification：×100

图2 IGFBP-1在不同组内表达情况

A: IGFBP-1在正常胎盘组织中的表达；B: IGFBP-1在妊娠期高血压胎盘组织的表达；C: IGFBP-1在轻度子痫前期胎盘组织中的表达；D: IGFBP-1在重度子痫前期胎盘组织中的表达. Original magnification：×100

图3 抵抗素在不同组内表达情况

A: 抵抗素在正常胎盘组织中的表达；B: 抵抗素在妊娠期高血压胎盘组织中的表达；C: 抵抗素在轻度子痫前期胎盘组织中的表达；D: 抵抗素在重度子痫前期胎盘组织中的表达. Original magnification：×100

2.4 不同预后HDCP患者 IGF-Ⅱ、IGFBP-1和抵抗素表达情况比较 120例HDCP患者发生胎儿生长受限23例，新生儿窒息17例，死亡1例，其中4例患者同时伴胎儿生长受限和新生儿窒息，总共37例不良预后患者。结果(表3)表明：预后不良组 IGF-Ⅱ阳性表达明显低于预后良好组，而IGFBP-1 和抵抗素阳性表达水平明显高于预后良好组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表3 不同预后妊高症患者 IGF-Ⅱ、IGFBP-1和抵抗素表达 n (%)

3 讨 论

HDCP是妊娠期女性最常见并发症之一[8]。目前关于HDCP的具体发病机制依然不十分明确，但是较一致的理论认为：该病起源于胎盘病理改变，胎盘绒毛外滋养细胞因受各种因素影响导致其浸润、侵蚀能力减弱，抑制了螺旋动脉重构过程，进而造成胎盘血流灌注不足，使其长期处于缺血、缺氧状态，最终导致母体血压升高、内皮功能损伤等情况的发生[9]。临床有研究[10-11]显示，IGF-Ⅱ、IGFBP-1是影响胎盘滋养细胞浸润、侵蚀能力的因素之一。IGF-Ⅱ属于单肽类物质，可抑制脂肪降解，刺激蛋白质、脂质、糖原以及碳水化合物代谢，并促进细胞分化、增殖，可同滋养细胞IGF-Ⅱ受体相互结合从而提升滋养细胞浸润、侵入作用，促进胚胎着床[12]。Shin 等[13]用蛋白印迹技术分析了正常妊娠产妇和HDCP患者中IGF-Ⅱ的表达量，发现HDCP患者胎盘IGF-Ⅱ表达水平显著降低，且与病情严重程度负相关。姚金翠等[14]同样报道：HDCP患者胎盘组织中IGF-Ⅱ水平与妊娠期高血压疾病严重程度负相关。

IGFBP-1是由肝、肾、子宫等器官组织分泌的激素之一，同时属于IGF结合蛋白家族成员之一，其本身具备自分泌、旁分泌、内分泌的作用，且临床研究已证实IGFBP-1是参与IGF-1调节作用的重要因子，同时具备促进细胞增殖、抑制代谢、促进血糖升高等独立于IGF作用之外的功效，是蜕膜过程中表达最丰富的蛋白。早期研究报道蜕膜可抑制胚泡着床，提示在母胎相互作用过程中IGFBP-1可能发挥局部调节作用，而IGFBP-1异常表达可能会诱发孕产妇妊娠期相关并发症[15-16]。本研究结果显示，IGF-Ⅱ在正常孕妇胎盘组织中镜下可见大量棕黄色或深棕黄色沉着颗粒。而IGFBP-1在HDCP患者特别是重度子痫前期患者的胎盘组织中大量表达，并且随着妊娠期高血压疾病逐渐加重，胎盘组织中IGFBP-1表达逐渐升高，IGF-Ⅱ表达随之下降。这一结果说明IGFBP-1水平升高会导致游离状态的IGF-Ⅱ水平下降，因此IGFBP-1与IGF-Ⅱ表达负相关 ，这与以往Paul等[17]的研究结果相一致。该研究[17]认为IGFBP-1可能抑制IGF-Ⅱ的生物学活性，而IGF-Ⅱ 既可促进滋养层细胞增殖、分化和迁移，也可促进蛋白酶的分泌及胚泡植入，IGFBP-1 通过对IGF-Ⅱ的影响，有可能导致滋养细胞侵蚀障碍，从而引发HDCP。

抵抗素是具有胰岛素抵抗作用的脂肪因子，近年来临床研究发现抵抗素的蛋白分子结构与炎症因子相似，在脂肪细胞、单核细胞中均可表达，同时促炎细胞因子能明显提升人单核细胞中抵抗素的表达，故将抵抗素视为炎性细胞因子的效应因子，具有调节胰岛素敏感性作用[18]。近年来的研究显示抵抗素与HDCP的发病密切相关[2,19]，而本研究结果同样证实抵抗素在HDCP的胎盘组织中表达水平高于正常妊娠的胎盘组织，并且与IGFBP-1表达正相关，与IGF-Ⅱ表达负相关。这一结果证实抵抗素水平与HDCP的发生具有一定的相关性，原因可能是因为血管重塑障碍，血管内环境功能紊乱等一系列病理生理改变导致HDCP发病，而抵抗素在这一过程中能够促使母体的血管内皮发生损伤[20]，而血管内皮的损伤又间接导致了细胞滋养细胞的入侵能力下降，反射性影响了IGF-Ⅱ和IGFBP-1水平表达，其具体的机制有待进一步的研究。

IGF-Ⅱ、IGFBP-1和抵抗素可能与HDCP发病及病情严重程度具有一定的相关性，而目前对于3种指标是否与HDCP的妊娠结局是否存在相关性，罕有相关报道。为此，本研究进一步观察了预后不良HDCP患者和预后良好组患者的胎盘IGF-Ⅱ、IGFBP-1和抵抗素的阳性表达情况，结果显示预后不良的患者胎盘组织IGF-Ⅱ表达水平明显低于预后良好组，而IGFBP-1水平和抵抗素表达水平明显高于预后良好组。结果说明3种指标与HDCP的妊娠结局具有一定的关系，这3种指标的变化可能与HDCP胎盘供血不足、缺血缺氧、功能障碍等情况密切相关，从侧面反映了与胎盘功能有关，具体的机制有待进一步研究。随着妊娠期高血压病逐渐加重，胎盘组织中IGF-Ⅱ表达随之下降，抵抗素、IGFBP-1表达逐渐升高， 并且3种因子在HDCP胎盘组织中存在相关性，提示3种因子可能在HDCP的发病过程中发挥一定的作用，同时3种指标与妊娠结局可能存在一定的关系，但是3种指标是否可作为预测和判断HDCP的发生、严重程度及妊娠结局的指标，尚需进一步的研究。