颜超跃 艾梦燕 汤 承

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610225）

Nebovirus（NeV）是杯状病毒科（Caliciviridae family）纽布病毒属（Nebovirus genus）唯一成员（https：//talk.ictvonline.org/）。NeV为单股正链RNA病毒，是致犊牛腹泻的病毒[1-4]。根据RdRp基因序列，NeV可以分为2种基因型（NB-like和NA1-like）；根据完整VP1序列，NeV可以分为2种基因型（基因1型和基因2型），其中基因1型又细分为4个谱系（谱系1～4）[5]。迄今为止，NeV已经在美国、英国、巴西、土耳其、日本等12个国家检出，具有广泛的地域分布[6-16]。最近本实验室首次证实NeV在国内的存在，并在国内奶牛中广泛流行[17，18]。

NeV基因全长7，453～7，454 bp，分为2个ORFs[19]。ORF-1的长度为2，210个氨基酸（aa），依次编码P34、NTPase、P30、VPg、3CLpro、RdRp和VP1蛋白[20]。ORF-2的长度为225 aa，编码次要衣壳蛋白（VP2）[2]。NeV的VP1基因的核苷酸长度为1，650 bp，编码549个氨基酸（aa）。NeV VP1是重要的结构蛋白，参与病毒与组织血型抗原（HBGAs）的结合[21]。此外，其它杯状病毒的VP1被证实具有宿主特异性、抗原性和免疫原性[22-24]。NeV VP1由P结构域和S结构域组成[25]。P结构域进一步分为两个子结构域，P1和P2。其中高度突变的P2结构域含有受体结合位点，负责宿主特异性和毒株多样性[26]。

本次研究旨在进一步了解国内牛NeV VP1分子的特征，为NeV的防控和疫苗的制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集

2018年10月，从辽宁某牧场采集20份奶牛腹泻样本于-80℃保存。

1.2 主要试剂与仪器

TRIzolTMReagent、PrimeScriptTMRT reagent Kit、pMDTM19-T Vector均购于TaKaRa公司；感受态细胞DH5ɑ、Cycle-pure Kit、Gel Extraction Kit均购于大连宝生物工程股份有限公司。高速冷冻离心机5810R（德国Eppendorf）；普通梯度PCR仪（美国BIORAD）；凝胶成像分析系统5200Multi（中国天能）；电泳电源EPS300（中国天能）。

1.3 RNA的提取及cDNA的合成

将腹泻粪便样本与PBS按照1：5（W：V）的比例重悬混合，5000 r/min离心4 min，取400 μl上清液于1.5 ml的Ep管中，按照TRIzolTMReagent的说明书提取总RNA，并按反转录试剂盒说明书将提取的总RNA反转录成cDNA。……