张芳芳 高 巍 时振振 王国钉 何坤明 白新鹏

(海南大学食品学院;生物活性物质与功能食品开发重点实验室;热带多糖资源利用教育部工程研究中心，海口 570228)

淀粉是植物光合作用合成的主要的碳水化合物之一，以淀粉颗粒的形式贮存于不同植物的种子、根茎、果实中[1, 2]。据研究表明不同来源的淀粉在形态结构及理化性质上各不相同，从而导致其对应的功能性截然不同[3]。淀粉是一种越来越受欢迎的生物大分子材料，广泛地被应用于食品工业、医药、化工等领域[4-6]。

茶叶籽是茶叶生产的副产物，我国是茶叶生产的故乡，茶园面积约占2 700万亩，茶叶籽年产量达到80万吨[7]，大量的茶叶籽资源通常弃之不用，造成茶叶籽资源的严重浪费。茶叶籽中含有丰富的营养物质，如油脂、蛋白质、淀粉、茶皂素、纤维素等[7]。茶叶籽中含有质量分数约 15%～20%的淀粉，可作为替代淀粉的潜在资源[9]。目前，关于茶叶籽淀粉提取工艺的研究，国内外有少量的文献报道[10,11]。其中，肖龙艳等[12]利用超声波辅助提取法提取茶叶籽淀粉，其提取率达到81.93%，但只是关于其工艺的研究，缺乏对茶叶籽淀粉理化性质、颗粒大小、形态、结构特性等的综合性研究分析。

本研究以贵州产地提供的茶叶籽为原料，通过超声波辅助提取茶叶籽淀粉，考察超声时间、超声功率、液料比、超声温度等因素对茶叶籽淀粉提取率的影响，响应面优化超声波辅助提取茶叶籽淀粉的最佳工艺，探讨利用茶叶籽作为淀粉的替代来源，与传统的商业淀粉：玉米淀粉、小麦淀粉进行比较，对其理化性质、颗粒大小、形态、结构特性等方面进行了初步研究,为茶叶籽淀粉的综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶叶籽由贵州省毕节市提供；乙醇95%、硫酸、硫酸钾、硫酸铜、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、盐酸、硫酸铵、蔗糖、氢氧化钠、无水碳酸钙、考马斯亮蓝：均为分析纯，广州试剂化学厂。

1.2 仪器与设备

K9860全自动凯氏定氮仪；XO-5200DTD超声波清洗仪；HG63水分测定仪； TENSOR27傅里叶变换红外光谱仪。

1.3 提取工艺流程

茶叶籽→去壳→清洗→去皮→烘干→粉碎→脱脂→粉碎→过80目筛→调整液料比→超声辅助提取→离心(3 000 r/min，离心10 min)→水洗精制(三次)→离心→干燥(水分<15%)→过80目筛→实验备用。

1.4 茶叶籽淀粉含量及纯度的测定

茶叶籽淀粉含量的测定方法参照GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的测定：第二法酸水解法》测定；茶叶籽淀粉的纯度测定方法参照GB/T 20378—2006《原淀粉：淀粉含量的测定：旋光法》测定。计算茶叶籽淀粉提取率：

茶叶籽淀粉提取率/%=m/M×100

式中：M为茶叶籽粉中总的淀粉质量/g；m为提取的茶叶籽淀粉质量/g。

1.5 超声辅助提取茶叶籽淀粉单因素及响应面实验设计

1.5.1 超声时间对茶叶籽淀粉提取率的影响

称取茶叶籽粉10 g (颗粒度80目)，液料比4∶1(mL/g)、超声功率120 W、超声温度50 ℃条件下，超声处理10、20、30、40、50 min后，用纱布过滤，滤液经离心后取沉淀，冷冻干燥，计算茶叶籽淀粉提取率。

1.5.2 超声波功率对茶叶籽淀粉提取率的影响

称取茶叶籽粉10 g (颗粒度80目)，液料比4∶1(mL/g)、超声时间30 min、超声温度50 ℃条件下，超声波功率为24、72、120、168、216 W处理后，用纱布过滤，滤液经离心后取沉淀，冷冻干燥，计算茶叶籽淀粉提取率。

1.5.3 液料比对茶叶籽淀粉提取率的影响

称取茶叶籽粉10 g (颗粒度80目)，液料比为2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1 (mL/g)条件下， 超声功率120 W、超声温度50 ℃、超声时间30 min处理后，用纱布过滤，滤液经离心后取沉淀，冷冻干燥，计算茶叶籽淀粉提取率。

1.5.4 超声温度对茶叶籽淀粉提取率的影响

称取茶叶籽粉10 g (颗粒度80目)，液料比6∶1 (mL/g)，超声功率120 W，考察超声温度为30、40、50、60、70℃条件下，超声时间30 min处理后，用纱布过滤，滤液经离心后取沉淀，冷冻干燥，计算茶叶籽淀粉提取率。

1.5.5 响应面优化实验设计

在单因素实验基础上，选出影响较显著的3个因素：超声时间、超声功率和液料比为响应因子，茶叶籽淀粉提取率为响应值，通过中心组合实验Box-Behnken设计方案[13]，进行3因素3水平实验分析。

表1 实验自变量因素与水平

1.6 茶叶籽淀粉理化特性的分析

1.6.1 淀粉溶解度、膨润力的测定

取一定量绝对干样品加入适量蒸馏水，于30 ℃条件下边加热保温边搅拌30 min，防止淀粉沉淀，然后3 000 r/min离心30 min，取上清液在蒸汽浴上蒸干，于105 ℃烘至质量恒定，称量，计算淀粉溶解度、膨润力[14]。

溶解度(S)/%=A/m×100

膨润力(B)/%=P/m(100-S)×100

式中：A为上清液蒸干质量恒定后质量/g；m为绝干样品质量/g；P为离心后沉淀物质量/g。

1.6.2 淀粉粒度大小的测定

采用激光衍射仪(Mastersizer 2000, Malvern Instruments, Worcestershire, UK)测量淀粉颗粒大小分布。在室温条件下测量，用去离子水作为淀粉粒的分散剂 (水折射率为1.33)[15]。

1.6.3 淀粉颗粒形态特征的研究

取少量的样品，涂抹于粘有导电胶布的载物台上，按压均匀后，用洗耳球将多余未粘牢的淀粉吹掉。将载物台置于离子溅射仪中镀金处理，将处理好的样品放入扫描电子显微镜中观察并拍摄颗粒形貌，测量颗粒粒径[16]。

1.6.4 傅里叶变换红外(FTIR)测定

用Varian 7000 FTIR光谱分析仪对淀粉进行了分析，并采用DTGS检测器，该检测器同时配备红外光谱法全反射率(ATR) ，其含有锗晶体的光反射设备(45°入射角)(PIKE Technologies, USA)。用相似的方法测定[17]。

2 结果与分析

2.1 茶叶籽组成分结果分析

对茶叶籽原料进行常规的组成分分析，如表2所示，茶叶籽中含有14.78%的油脂，茶皂素质量分数10.22%，总的淀粉质量分数19.87%，可知茶叶籽中含有丰富的淀粉。若将其充分利用，不仅可以提供丰富的代替淀粉资源，而且可为茶叶籽的综合开发利用提供广阔的市场前景。

表2 茶叶籽原料的主要组成分分析

2.2 单因素实验

2.2.1 超声功率对茶叶籽淀粉提取率的影响

由图1可知，超声波功率为24～120 W范围内，茶叶籽淀粉的提取率随着超声功率的增大而逐渐升高，超声波功率为120 W时，茶叶籽淀粉的提取率达到最大，随后继续增大超声波功率，茶叶籽淀粉的提取率反而呈降低趋势。可能是随着超声功率的增大，超声波的空化作用增强，空化作用可产生瞬时高温高压，气泡在崩溃时产生强烈的机械作用，在液体中引起强大的冲击波促使高聚物分子在超声波的作用下产生裂解，当分子链的链长减小时，高聚物的降解速度也随着降低，并且在链断裂的地方形成了自由基，这些自由基能和氧或者其他的自由基反应，如果有单体在亦可以引起单体间的聚合反应，生成嵌段或者产生接枝共聚物，从而造成茶叶籽淀粉提取率的降低[18,19]。因此，选择超声功率为120 W。

图1 各单因素对茶叶籽淀粉提取率的影响

2.2.2 超声时间对茶叶籽淀粉提取率的影响

由图1可知，超声时间在10～30 min范围内，随着超声时间的延长，茶叶籽淀粉提取率显著升高，超声时间为30 min时，茶叶籽淀粉的提取率达到最大，继续增加超声时间，茶叶籽淀粉提取率呈下降趋势，分析其原因可能是茶叶籽淀粉长时间处于高温下发生了降解、糊化、缩合等反应。因此，选择30 min为最佳超声时间。

2.2.3 液料比对茶叶籽淀粉提取率的影响

由图1可知，随着液料比值的增加，茶叶籽淀粉的提取率逐渐增加，液料比为6∶1 (mL/g)时，茶叶籽淀粉的提取率达到最高，随后随着液料比继续增大，茶叶籽淀粉的提取率逐渐下降。提取液的增加，促使茶叶籽粉与提取溶液的充分接触，有利于茶叶籽淀粉的浸出。但液料比值达到6∶1(mL/g)时，茶叶籽淀粉的浸出基本达到饱和。当溶剂量继续增加，溶液离心次数增多，导致一部分茶叶籽淀粉混合在离心液中流失，从而影响茶叶籽淀粉的提取率。综合考虑，故选取液料比为6∶1(mL/g)。

2.2.4 超声温度对茶叶籽淀粉提取率的影响

由图1可知，超声温度在30～50 ℃范围内，随着超声温度的升高，茶叶籽淀粉的提取率随之增加，超声温度增加到60 ℃时，茶叶籽淀粉提取率达到最高，继续增加超声温度，茶叶籽淀粉的提取率上升较缓慢，随后趋于稳定。淀粉属于多羟基化合物，提高超声温度有利于淀粉浸出，但温度过高则会影响淀粉的稳定性，促使淀粉糊化，引起茶叶籽粉颗粒间蓬松性变得致密，部分淀粉被夹裹于致密的茶叶籽颗粒中，不利于淀粉浸出[20]。在不破坏茶叶籽淀粉质构的基础上，综合考虑，故选取最佳超声温度为50 ℃。

2.3 茶叶籽淀粉提取工艺回归模型的建立及方差分析

在超声波辅助提取茶叶籽淀粉工艺中，选择影响较为显著的因素：超声波功率(A)、超声时间(B)、液料比(C)为实验优化自变量，以茶叶籽淀粉提取率(Y)为响应值，采用Design-Expert软件对表3、表4中实验结果进行响应曲面分析，得到回归方程：

Y=97.88+2.69A+0.82B+3.93C+2.42AB-1.77AC-1.25BC-3.29A2-4.05B2-7.42C2

表3 超声波辅助提取茶叶籽淀粉工艺响应面实验结果与分析

表4 各因素和回归方程的方差分析

注：*差异显著P<0.05；**差异较显著P<0.01；***差异极显著P<0.001；R2=0.996 8；R2=0.992 8。

根据实验结果进行方差分析，从表4可知，该模型中F值为245.34，P<0.000 1，达到极显著水平。失拟项差异不显著(P=0.053 9>0.05)，表明该回归方程对试验拟合程度较好。

对回归方程的显著性进行检验分析，表明超声波辅助提取茶叶籽淀粉工艺条件中超声功率A、超声时间B、液料比C及二次项A2、B2、C2分别对茶叶籽淀粉的提取率影响极显著；交互项AC、AB、BC分别对茶叶籽淀粉的提取率影响较显著(P<0.01)。结果表明，模型回归系数R2=0.996 8，校正决定系数R2=0.992 8。 因此使用此模型对超声波辅助提取茶叶籽淀粉提取率的分析和预测是可靠的。

2.4 响应面分析与及优化

根据回归方程，考察交互项对茶叶籽淀粉提取率的影响，经Design-Expert软件分析所得等高线图，如图2所示。

由表4可知，响应面值开始随着各因素的增加而增加，达到最高点后，响应面值逐渐呈降低趋势。等高线图可直观地反应各因素对茶叶籽淀粉提取率的交互作用程度，等高线呈圆形表示两因素交互作用不显著，等高线呈椭圆形或马鞍形则表示两因素交互作用显著[21]。由图2中可以看出，超声功率A、超声时间B、液料比C的等高线图呈明显的椭圆形，表明两因素交互作用明显。

2.5 验证实验

为了确定响应面法所得结果的可靠性，利用 Design-Expert 软件进行分析，得到最佳茶叶籽淀粉提取率的工艺条件：超声功率120 W；超声时间30 min；液料比6∶1(mL/g)，在此工艺条件下茶叶籽淀粉的提取率高达98.28%。在此优化条件下进行3次平行试验，实际结果表明茶叶籽淀粉的提取率为 98.12%，实际值与理论值较为接近。表明该回归模型能够很好地反映各因素对茶叶籽淀粉的提取率的影响，并证明了使用该方法研究超声波辅助提取茶叶籽淀粉工艺的可行性。

2.6 茶叶籽淀粉理化指标的分析

由表3可知，不同来源的淀粉，其化学组成分及产品性质具有一定的差异。目前淀粉行业一般以产品的纯度、蛋白含量、脂肪含量、灰分、直链淀粉含量、支链淀粉含量、水分等理化指标衡量淀粉质量的优劣。由结果可知茶叶籽淀粉符合国家相关标准。

2.7 淀粉颗粒大小与SEM形态分析

如图3和表6所示，茶叶籽淀粉的粒径分布与玉米淀粉、小麦淀粉的粒径分布进行了比较，结果表明，茶叶籽淀粉的粒度分布中值最小(1 718 nm)。原因可能是由于超声波的气室效应对茶叶籽淀粉颗粒产生切削作用，使其细胞破碎，降低了茶叶籽淀粉的分子质量，导致其淀粉粒度分布中值减小[22]。图4中扫描电镜(SEM)图像表示，茶叶籽淀粉颗粒形态程规则的球形；玉米淀粉粒度中值最大 (5 125 nm)，颗粒形态程多角形，这可能与玉米淀粉颗粒多呈双模态分布有关，大部分淀粉粒子聚集在一起，从而导致其粒度中值偏大；小麦淀粉颗粒形态大部分呈不规则椭圆形，小的呈圆形。不同来源淀粉颗粒形态各不相同，原因可能与不同淀粉颗粒包裹薄壁组织细胞的紧密度有关[23]。

图2超声功率、超声时间和液料比对茶叶籽淀粉提取率影响的等高线图

表5 茶叶籽淀粉与玉米淀粉、小麦淀粉理化指标

图3 茶叶籽淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉粒径大小的分布

图4 从左至右茶叶籽淀粉、玉米淀粉和小麦淀粉的SEM图×1 000倍

表6 茶叶籽、玉米和小麦淀粉颗粒大小、溶解度、膨胀力

样品颗粒大小/nm溶解度/%膨胀力/%茶叶籽1 718±0.0122.19±0.0340.75±0.01玉米5 125±0.0212.28±0.0116.05±0.09小麦5 022±0.0524.7±0.0311.87±0.02

淀粉膨胀力的大小体现了淀粉水结合能力的高低，反映淀粉粒子间化学键结合类型及结合程度。表6中表明，茶叶籽淀粉的溶解度为22.19%远大于玉米淀粉的溶解度；茶叶籽淀粉溶胀力最大为40.75%。可能是由于超声波对茶叶籽淀粉细胞的破碎及分散作用，从而降低淀粉颗粒间化学键的结合程度，导致其膨润力升高[24]。

2.8 红外光谱分析

为了进一步更好的分析茶叶籽淀粉的结构特征，对茶叶籽淀粉与玉米淀粉、小麦淀粉做了红外光谱对比试验分析。

图5 茶叶籽淀粉与小麦淀粉、玉米淀粉红外光谱图

3 结论

超声波辅助提取茶叶籽淀粉，在单因素试验基础上利用响应面优化试验进行分析，确定最佳的提取工艺：超声功率120 W；超声温度50 ℃；超声时间 30 min；液料比6∶1(mL/g)，在此工艺条件下茶叶籽淀粉的提取率达到98.28%，比传统的水提法提高了16.35%。

茶叶籽淀粉纯度为84.52%，蛋白质质量分数为0.54%，脂肪为0.34%，灰分为0.17%；颗粒大小为1 718 nm，溶解度22.19%，膨胀力40.75%；通过SEM图像可知茶叶籽淀粉颗粒形状呈规则的球形；红外光谱分析得到茶叶籽淀粉处于缔合状态的氢键较多。本试验结果为茶叶籽淀粉的进一步分离纯化和理化特性、形态结构的分析提供了参考。