周 颖 惠延波 冯兰芳 闫 磊 马晓晓

(河南工业大学，郑州 450001 )

小麦在储藏期间，外界的高温高湿空气或粮堆湿热扩散量超过籽粒水分平衡速度时，特别容易被霉菌和真菌降解，被霉菌真菌病原体感染的核会导致干物质含量和核密度的降低，在粮仓中经常会出现结顶、挂壁、点翠等现象。霉菌是粮食储藏期危害严重的微生物类群，霉菌的次级代谢物会引起粮食品质的劣变和真菌毒素的产生。据统计，粮食生产因霉菌活动导致的损失率约占粮食总产量的3%以上，霉菌在造成经济损失的同时也给食品安全带来了严重的不确定性[1,2]。掌握粮食中霉菌生长代谢规律，及早的发现霉菌，对确保储粮安全意义重大。

小麦籽粒最外层有一层坚硬的组织叫种皮，它包围着胚乳和胚芽， 因此在不破坏内核、无损的情况下来研究霉菌污染对内部籽粒结构的影响是非常困难的。常规的“平皿菌落计数法”、基于细胞中酶活性变化的“微生物活性检测方法”主要局限于检测粮粒外部霉菌量的变化[3-5]，基于微生物生长代谢活动导致温度和呼吸强度变化的“电子测温”和“二氧化碳检测”的方法是间接的，通常是在粮仓或大型粮堆中检测，但其监测霉菌生长活动的起点较实际滞后[6-9]。微生物的生理活动不仅会消耗粮食中的成分，而且会破坏粮食的组织、结构，目前对小麦籽粒本身感染霉菌后内部结构的变化研究较少。传统的图像分析技术如光学显微镜(LM)、扫描电子显微镜(SEM)、激光扫描共聚焦显微镜(CSLM)、聚离子束扫描电子显微镜(FIB-SEM)、原子粒显微镜(AFM)等。这些图像分析技术在样件制备的过程中需要对样件进行切片和化学处理, 耗时、危害健康、污染环境，对制备的切片进行分析时仅能够得到样件内部的结构信息,不能给出整个籽粒内部三维内核的各向异性信息,而且样件可能经过切片和化学处理后会破坏原始结构并引入成像伪影。

X射线显微计算机断层扫描技术是一种非破坏性的三维成像和分析技术，用于无损分析各种材料的内部结构特征或用于材料内部缺陷的检测，最近作为食品科学领域一种较为新颖的方法，已被成功地应用于获取不同理化条件下食品的微观结构信息[10-13]。Gubatz等[14]利用连续切片重建发育的大麦籽粒的数字模型，该模型提供了在开花期，胚乳发育合胞期和淀粉积累开始时发育谷物的详细空间描述。Schulze等[15-17]利用X射线分析了真空浸渍槲皮素衍生物对苹果薄壁组织强化的影响及苹果果核内孔隙结构及分布。Zhu等[18]通过X射线显微CT研究高直链淀粉和野生型水稻的籽粒结构，实现了内核结构的三维表征。Orina等[19]利用X射线显微CT无损的分析感染轮状镰刀菌的玉米籽粒的内部结构。X射线提供了获取完整三维结构图像手段，以非破坏性方式在微观层面上展示可视化内部结构，对图像进行分析处理还可以实现内部结构数据的量化。因此，该技术不仅用于内部特征的定性描述，而且还可用于定量分析。

X射线三维显微镜是采用传统CT技术与光学显微技术结合，X射线断层扫描是一种无创伤和无损成像技术，可用于高分辨率的三维可视化和表征。X射线源发射出来的射线束，在穿过待测样本时与待测样本发生作用，由于样本内的密度和成分差异，待测对象的不同部位对X射线的吸收率不同造成X射线的衰减，样本内的X射线衰减的变化产生不同的图像对比度。用X射线三维显微测试系统，将样本旋转得到一系列不同灰度的二维X切片，这一系列切片，覆盖整个样本，可以被渲染成一个三维的图像，可以在不同的深度和不同方向作为一个整体或虚拟切片如图3所示。本研究的目的是确定X射线显微CT是否是研究小麦籽粒霉变后内部微观结构变化的有效手段，通过对二维截面图分析霉变后籽粒内部结构的变化与不同，通过对图像进行重建和渲染，实现对感染籽粒及内部孔隙的三维可视化，除了可视化还可以获取籽粒体积、籽粒内部孔隙率等参数。为进一步探讨粮食内部的孔隙与粮情之间的关系提供参考。

1 材料与方法

图1详细介绍了用X射线断层扫描方法无损研究霉变对小麦籽粒三维结构的影响的实验流程图。

图1 用X射线显微CT分析发霉对籽粒微观结构影响的流程图

1.1 实验材料

实验材料选用小麦品种为周麦26，由河南工业大学实验田提供，随机取部分实验籽粒

〗利用ASAE S352标准把小麦籽粒在130 ℃条件下烘干19 h，通过测量烘干前后水分的损失测得的初始含水率为12%。小麦中按NYT1094.1—2006标准中规定润麦加水量公式(1)计算润麦加水量，加入一定量的无菌水，均匀混合，然后置于5 ℃以下的冷藏箱中存放48 h，调制后实验样品的初始含水量26%。

(1)

1.2 发霉样件

2种发霉的样件如图2所示，图2a为常温条件下发霉的样件：将调制后含水量为26%的小麦装入1 000 mL的广口瓶中，用保湿剂(含氯化钠8%，甘油10%)浸泡过的棉纱布将瓶口覆盖8层，放在常温下；图2b为恒温恒湿箱中模拟储藏条件的发霉样件：将调制后含水量为26%的小麦装入1 000 mL广口瓶中，用保湿剂(含氯化钠8%，甘油10%)浸泡过的棉纱布将瓶口覆盖8层，置于德国BINDER恒温恒湿培养箱，调整培养箱的温度为28 ℃，将湿度调节至接近小麦平衡水分的范围，保持小麦水分在整个实验周期中基本稳定。在本实验条件下小麦的含水量变化不超过0.5%。7 d后各取6粒样件放置X射线微米CT执行扫描。

图2 小麦籽粒感染霉菌图

1.3 实验方法

用Y.CHEETAN型微米X射线断层CT进行扫描，设置工作参数：电压70 kV，电流40 μA,测量分辨率为7.14 μm。 测试时首先将小麦籽粒用泡沫块固定，注意在固定时尽量避开小麦籽粒发霉的部位。再用双面胶将固定好小麦籽粒的泡沫块粘接在旋转柱上，粘接牢固后放置旋转台，在旋转台上保持射线源和探测器不动；旋转台旋转1个小角度，探测器采集1组数据，直至旋转台转360°，完成1次圆周的扫描，扫描时不需要人工协助机器完全自动化操作，扫描大概需要20 min，扫描完成获取1024张二维切片。

图3 X射线的三维视图及对应的二维截面视图

2 图像处理与重构

从Y.CHEETAH X射线CT中采集从不同角度对小麦籽粒的投影成像图，需要对其进行重建才能得到小麦籽粒的三维结构。在Image J软件中实现了对1 024张切片的重构可视化与定量分析。应用了非局部均值滤波算法对图像采集过程中由于人为、设备等各方面的原因携带的各种噪声信号进行去除，在去除噪声的同时，最大限度的保持图像轮廓，纹理等细节特征。同时又使用了交互式阈值分割算法将样品信息与背景信息，样品内部不同特征区域划分出来。通过渲染对重建后的模型进行三维可视化，渲染是观察和可视化内部形态和微观结构所必需的，通过渲染对不同组织结构赋予不同的颜色，把不同的组织结构从整体中剥离出来，得到籽粒的三维形态信息及样品局部细节信息，可以直观形象地观察籽粒的三维形貌。

3 参数计算

通过X射线显微CT再附加相关的重建算法，可以实现对小麦籽粒内部孔隙结构的重建表征，获取如籽粒体积、孔隙体积、孔隙大小分布、孔隙率等参数。重构切片上的每个像素代表了体积图像中的一个立方体体素，经过阈值分割后的三维数据每个组织结构所占的体素数量都是已知的，目标体积可以通过公式(2)获取。

V=S×N

(2)

式中：S为每个体素体积；N为体素的个数。

孔隙率是孔隙空间的体积与样品总体积的比率,如公式(3)，以百分比表示。

(3)

式中：P为孔隙率；V1为空气体积；V2为籽粒体积。

4 结果分析与讨论

X射线显微CT基于图像对比度，该图像对比度由样本内的X射线衰减的变化产生，X射线衰减的变化可归因于样本内的密度和成分差异。使用阈值分割程序从背景中分割籽粒可以得到籽粒的灰度直方图如图4所示，灰度值范围从0到655 35之间，灰度值与图像对比度有关，如果灰度值集中在图像的下端，图像的亮度比较暗，相反灰度值集中在上端图像就会比较亮。整个核灰度直方图的不同峰值对应了不同的相位，低灰度值对应于内部的空气，高灰度值对应于核结构。发霉后籽粒灰度值的频率在0～10 000范围内有升高的趋势，说明空气相增多，孔隙增加。

图4 小麦籽粒的灰度直方图

4.1 霉菌生长部位分析

小麦籽粒的解剖结构有种皮，胚乳，胚，盾片组成，它们具有不同的化学成分，这些解剖结构在微生物生长代谢的作用下组织会发生变化，X射线显微CT能够根据它们在X射线衰减方面的差异将这些结构组件在内核中区分开来。

图5展示了不同条件下小麦籽粒水平视图和矢状图。从二维截面图上可以看出小麦籽粒感染霉菌初期，霉菌生长代谢首先出现在小麦籽粒的胚部，胚部丰富的营养为霉菌的生长代谢提供了适宜的基质，霉菌初期在小麦籽粒上生长呈现向外繁衍的趋势。粮粒种皮的保护作用也是影响霉菌生长活动的重要因素[20]，胚部外围的皮层组织较其他部位皮层组织薄，对胚组织的保护弱，且皮层与胚之间存在着较大的孔隙，微生物生长所需环境条件主要有碳源物质、氧气、水和无机盐，皮层与胚之间的空隙为微生物的有氧呼吸提供了良好的空间。图5a为未感染霉菌的小麦籽粒的二维截面(水平、矢状)图，小麦皮层轮廓线清晰，胚组织紧密，吸收X射线的能力较强，图像灰度值高更亮。图5b为常温下发霉小麦籽粒的二维截面(水平、矢状)图，霉菌感染初期菌丝及孢子数量少，对X射线的吸收较少，图像灰度值低，亮度低。图5c模拟储藏环境下感染霉菌小麦籽粒的二维截面(水平、矢状)图，皮层的轮廓线较模糊，且胚部的图像的灰度值也较其他未感染籽粒低，主要储粮微生物含有多种酶类，它们可以通过呼吸作用，分解粮粒中蛋白质、淀粉、碳水化合物、糖类、纤维素、有机酸等有机物质，为其生长﹑繁殖﹑代谢所利用，导致内核的降解，胚组织密度降低[21]，吸收X射线的能力减弱，图像灰度值低，亮度变低。

图5 不同条件下感染霉菌的小麦籽粒的二维横截面图

4.2 发霉部位的三维可视化图

分割渲染重构后的小麦籽粒如图6所示。图6a为未霉变的籽粒，图6b为常温下发霉的籽粒，图6c为培养箱中模拟储藏条件感染霉菌的籽粒。图中红色部分为小麦籽粒的胚部，蓝色为胚乳部分，黄色为种皮部分，暗绿色为霉菌生长部位。从重构视图发现种皮与胚乳及胚部并不是紧密的贴合在一起，中间存在孔隙，种皮呈褶皱状覆盖在胚乳及胚组织的表面，小麦籽粒的背部的种皮褶皱多。小麦籽粒在常规自然条件下霉菌的生长代谢主要在胚部，在培养箱中霉菌的生长代谢主要集中在胚部，腹沟靠近果毛处也存在部分霉菌。

注：红色为胚，蓝色为胚乳，淡黄色为种皮，暗绿色为霉菌。图6 重构完成后小麦籽粒的三维视图

4.3 定量参数计算

籽粒内部的孔隙中游离的氧原子是碳水化合物、脂类和蛋白质等有机化合物主要组成成分，它在微生物细胞的结构和酶的功能方面起着重要的作用，对绝大多数微生物的生长代谢而言绝对是必要的。由于霉变导致小麦籽粒体积、内部孔隙度的变化和额外孔隙度的发展是有可能的，对霉变后小麦籽粒孔隙的表征与研究对于探究霉菌与孔隙之间的关系及霉菌内部生长代谢机理意义重大。体积的测定常采用液体置换法，孔隙的测定需要先测定容重、体积等参数在通过公式间接进行计算这些方法不能实现单个籽粒体积的计算，更不能实现籽粒内部孔隙的三维可视化。X射线断层扫描方法不仅可以获取一定量籽粒的体积、孔隙率，而且可以实现单个籽粒体积，内部孔隙的表征和定量计算。利用X射线首次实现了不同条件下小麦籽粒霉变后内部孔隙的三维可视化如图7。

图7 小麦籽粒的孔隙图不同颜色代表不同孔隙大小(培养箱发霉后)

获取了籽粒体积、孔隙体积及孔隙占籽粒总体积的比例等参数如表1。从这些视图中可以看出孔隙的大小、位置、分布等，孔隙多数集中在小麦籽粒腹沟内侧的种皮附近。培养箱里发霉籽粒的孔隙率要大于自然条件发霉的籽粒，这些参数将对研究孔隙与霉菌之间的关系提供良好的前提。

表1 小麦颗粒的几何参数

5 结论

研究表明高分辨率X射线显微CT是研究小麦籽粒感染霉菌后内部结构变化的一种有效的手段，通过对比不同状态下小麦籽粒的灰度值可以区分籽粒是否感染霉菌，通过X射线的二维截面视图发现盾片和种皮是小麦籽粒内部的致密区域，灰度值大、亮度高。胚组织外围的种皮较其它部位薄，对胚的保护力度较弱，小麦籽粒在感染霉菌后最先侵入的部位是胚部。小麦籽粒在模拟储藏条件下感染霉菌后，胚部营养物质被霉菌的生长代谢消耗导致核内干物质的分解，核密度的降低，吸收X射线的能力低，灰度值变低。根据X射线衰减方面的差异实现小麦籽粒内部结构及孔隙的三维可视化表征，统计并计算了小麦籽粒的体积、孔隙体积、孔隙率等参数。这些可以用于粮食籽粒储藏期间易发霉部位如(粮仓墙壁附近、粮粒表层)以及粮食在深加工前是否霉变的区分检测，也可以用于无损检测单颗小麦籽粒被生物材料损伤后微观结构组织的变化。通过对籽粒霉变形态结构做的基础性研究和参数的大量统计分析，有可能为后续无损检测仪器和快速检测仪器的开发提供参考。