邵小龙 徐水红 徐 文

(南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，南京 210023)

保障储粮品质对于维护国家粮食安全具有十分重大的意义。据相关资料显示，我国特别是农户的储粮损失约为6%～9%[1]，其中储粮害虫的危害性最大。储粮害虫主要分为粮粒内部害虫(隐蔽性害虫)和粮粒外部害虫，隐蔽性害虫整个生长过程都在粮粒内部完成，肉眼无法察觉，对粮食的危害最为严重。玉米象是一种最常见的粮食隐蔽性害虫，能引起粮食品质及数量的损失[2]。因此实现玉米象的早期检出对于提高我国储粮品质显得尤为重要。

软X射线作为一种快速无损的储粮害虫检测技术，具有悠久的发展历史[3,4]。图像像素值的大小反映了X射线穿透被检测物的衰减度，当粮粒受到害虫感染时密度发生改变引起X射线透射率的变化，故与正常粮粒相比X成像图片有所不同。Karunakaran等[5]研究表明软X射线可以准确判别超过95%的未感染小麦以及受不同阶段米象感染的小麦。Nawrocka等[6]使用软X射线成像测定被谷象侵染的小麦籽粒质量损失，根据质量损失的差异来确定谷象的不同虫态。单一的软X射线检测方法对于隐蔽性害虫的早期检出存在一定局限，Chelladurai等[7]将软X射线与近红外高光谱两者联用，大大提高了四纹豆象卵期以及早期幼虫的检测准确率。

低场核磁共振(low-field nuclear magnetic resonance，简写LF-NMR)是近些年发展起来的一种分析检测技术，在牛奶[8]、食用油[9～11]、肉制品[12,13]等异物或掺假检测方面表现出很好的检测效果，低场核磁能对氢质子(特别是水)快速准确检测，害虫侵入粮粒内部属于外来物，由于昆虫个体含水率与粮粒差别很大[14]，因此低场核磁有可能作为检测外来害虫的方法。

本研究通过软X射线拍摄的图片，观察玉米象在小麦内部的整个生长发育周期，提取未感染以及被不同阶段玉米象感染小麦的纹理特征，利用LDA与QDA分类模型判断不同分类情况下的判别准确率。将低场核磁引入储粮害虫检测领域，与高清软X射线拍摄图片相结合，测定玉米象在小麦体内的生长发育情况，根据玉米象与小麦特征峰值比例的变化，判断小麦是否受到玉米象感染并且处于哪种虫态。

1 材料与方法

1.1 实验样品

试验样品小麦为硬质红小麦，来自于南京市石埠桥粮食储备库，未试验前均放在4 ℃冰箱中储藏,为防止小麦中可能含有虫卵，实验前在80 ℃烘箱中烘2 h进行杀虫处理。试验样虫玉米象来源于粮食储运国家工程实验室(南京)培养的多代种群，置于温度(29±1)℃、相对湿度(65±2)%条件下生长繁殖。

1.2 实验设备

ZXFLASEE U微焦点X光检测仪；NMI20-Analyst型核磁共振分析仪；1001-1 型电热鼓风干燥箱；GNP-9160型隔水式恒温培养箱；JE1001型电子天平(精度为0.01 g)万能粉碎机。

1.3 实验方法

1.3.1 样品准备以及X射线图像获取

采用烘箱法调节小麦含水量12%左右，挑选约100 g小麦放入500头玉米象成虫置于温度(29±1)℃、相对湿度(65±2)%条件下生长繁殖48 h后移出所有成虫。共挑选252粒感染与未感染小麦，置于自制装样多孔板上每2天进行X射线图像采集，记录玉米象从卵、幼虫、蛹，成虫以及羽化而出的整个生长发育过程。

本研究中使用的软X射线成像系统(丹东中讯科技有限公司)包含实时图像采集，图像和视频保存，几何尺寸测量等。将小麦籽粒手动放置在样品台的自制多孔板上，并在30 kV电位和100 μA电流下进行X射线照射采集，直到多孔板上所有的籽粒成像完成。X射线仪的其他参数设置如下：窗宽3 275，窗位5 578，亮度0，对比度2。小麦籽粒的X射线图像以64像素mm-1的分辨率被数字化为8位灰度图像。

1.3.2 图像特征值的提取

纹理特征用于量化小麦籽粒灰度强度的空间分布。利用灰度共生矩阵和灰度游程矩阵共提取了小麦灰度图像的30个纹理特征[15～17]。灰度共生矩阵反映了图像灰度分布的方向、幅度和局部区域的综合信息，并且使用MATLAB程序提取了24个特征：在0°，45°，90°和135°处四个方向的四个GLCM特征(能量，熵，对比度，相关性)，四个平均值和四个标准偏差[17]。灰度游程矩阵代表在对象中出现相同或相似灰度级的共线和连续像素，并且使用MATLAB程序提取了6个特征：短程，长程，灰度不均匀性，运行百分比 ，运行长度不均匀，低灰度运行[17]。

1.3.3 分类判别

分类方法参照Chelladurai 等[7]。选择线性判别分析(LDA)和二次判别分析(QDA)作为分类判别模型, 用SAS9.4的DISCRIM程序采用差一法对未感染与不同感染阶段的小麦进行分类。通过X射线拍摄的图片，每个感染阶段挑选70粒样品进行分类判别。LDA和QDA模型的三种不同交叉验证如下：1)五类(未感染小麦、卵期、幼虫、蛹期以及蛀空粮粒); 2)三类(未感染小麦、卵期到成虫视为感染阶段以及蛀空粮粒);3)二类(未感染小麦与不同感染阶段)。

1.3.4 横向弛豫参数测定

实验前，通过核磁共振波谱分析软件中的FID(free induction decay)脉冲序列校准中心频率。实验时，每次称取(2.00±0.01) g小麦样品于直径15 mm的核磁管中，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脉冲序列测定样品的横向弛豫参数[18,19]，每组样品6个平行，重复3次，取平均值。设置CPMG脉冲序列的参数如下：主频SF=19 MHz， 90°脉冲射频脉宽P1=13 us，180°脉冲射频脉宽P2=25 μs，采样频率SW=200 kHz，回波时间TE=0.2 ms，重复采样等待时间TW=1 500 ms，回波个数NECH=3 000，重复采样次数NS=32。

1.4 数据分析

利用LF-NMR自带的CONTIN反演法对数据进行反演，用EXCEL(2013)软件对反演数据进行分析和绘图，用SAS9.4软件进行显著性差异分析，用SAS9.4的DISCRIM程序对所有的分类模型数据进行训练(Statistical Analysis Systems Institute, Inc., Cary, NC, USA)。

2 结果与分析

2.1 软X射线图片分析

玉米象是典型的粮食隐蔽性害虫，成虫产卵后将卵埋置于粮粒内部，幼虫在粮粒内生长发育，直至长成成虫从粮粒内部羽化而出，玉米象是主要的初期性害虫，会引起后期性虫害滋生，造成严重的粮食损失[20]，因此实现玉米象的早期检出显得尤为重要。玉米象在同一粒小麦体内的生长周期经软X射线检测后得到的图片如图1所示，未感染小麦由于未受到蛀蚀，整体质地比较均匀，当小麦受到玉米象感染之后，被蛀蚀以及产卵部分就会比较明亮。从图中可以看出，小麦受感染12 d玉米象处于卵期阶段，感染的16 d～24 d分别为1～4龄幼虫，1龄幼虫体积较小而且在小麦内部活动范围很小，没有大范围的侵蚀粮粒，感染的28 d玉米象处于蛹期阶段然后渐渐长成成虫并羽化而出。

图1 未感染小麦与被不同天数玉米象感染小麦的软X射线图片

2.2 玉米象在小麦体内生长阶段的分类结果分析

纹理特征描述的是图像表面的纹理信息，从宏观上反映了一些图像灰度变化的规律[21]。未感染小麦与被玉米象不同阶段感染小麦的表面纹理特征存在差异，因此纹理特征可用于不同感染阶段小麦的分类判别。本文共提取了30个纹理特征，用LDA与QDA分类模型进行判别分析，从表1可以看出，两种分类结果LDA的准确率普遍比QDA高，将未感染小麦与玉米象卵期、幼虫、蛹期及蛀空粮粒同时进行分类判别，LDA与QDA模型对未感染小麦的分类准确率最高，达到了90%以上。LDA模型对玉米象卵期、幼虫、蛹期及蛀空粮粒的分类准确率都在70%以上，卵期的分类准确率为74.3%，相较于Chelladurai 等[7]的研究，准确率有所提高；QDA模型的分类准确率随着玉米象的生长发育而逐渐提升。把卵期、幼虫以及蛹期统一归为感染阶段与未感染小麦及蛀空粮粒进行分类判别，发现两种判别模型对于未感染及感染小麦的判别准确率都在90%以上，相对来说，蛀空粮粒的判别准确率就有点低，因为蛀空粮粒往往会与蛹期感染小麦发生错误分类。

表1 利用LDA与QDA分类模型对未感染小麦与受不同阶段

为了得到未感染小麦与各个感染时期的分类准确率，将未感染小麦与各个不同感染时期分别进行分类判别。从表2可以看出，LDA与QDA模型对于所有感染类型的判别准确率都达到了95%以上，有的甚至为100%，未感染小麦与受玉米象卵期感染小麦两者之间较高的判别准确率可以表明在高清X光机的帮助下，能够清楚看到蛀蚀孔及卵的存在，因此有可能实现隐蔽性害虫玉米象的早期检出。

表2 利用LDA与QDA分类模型对未感染小麦与受不同阶段

2.3 玉米象在小麦体内生长发育的低场核磁分析

在LF-NMR中，常以氢核(1H)作为研究对象，弛豫时间用氢质子的横向弛豫时间表示[22]，小麦和玉米象的氢质子主要来源于水分子。一般情况下，昆虫的含水量远高于粮食的水分。例如，昆虫的水分约为65%，而粮食的正常储藏水分为12%～18%[14]。根据核磁共振弛豫时间T2反演谱图中波峰位置的不同，可以区分处于不同状态的水分。当水与物质结合越紧密时，相对质子自由度就越低，T2弛豫时间就越短；相反质子自由度越高时T2弛豫时间就越长[23]。结合高清X光机，在玉米象不同生长天数，挑选小麦内部只受一头玉米象感染的籽粒进行低场核磁检测，所得的T2反演图谱如图2所示，随着感染天数的增加，第一特征峰的峰顶点呈现先向右后向左移动的趋势，此峰代表的是小麦的特征峰(弛豫时间范围在0.47～1.14 ms之间)，表明受玉米象感染小麦内部的水分流动性发生了改变，那是因为玉米象在小麦内部生长发育，直接取食小麦籽粒，导致小麦内部的大分子结构遭到破坏。而且除36 d以外，随着感染天数的增加，第二特征峰表现的越来越明显，此峰代表的是小麦内部玉米象的特征峰(弛豫时间范围在43.29～200.92 ms之间)，36 d时，玉米象成虫已经钻出粮粒，蛀空粮粒相较于未感染及被感染小麦的水分含量都有所降低，导致峰的信号强度相对较弱。

图2 玉米象在小麦体内不同生长天数的低场核磁弛豫时间T2反演图谱

峰值比例的变化能更加直观的反映玉米象在小麦内部的生长发育情况。如图3所示，随着玉米象在小麦内部生长发育，峰值比例P2b呈先下降后上升的趋势，峰值比例P22呈先上升后下降的趋势，在感染的12 d，变化幅度非常细小，那是因为此时的玉米象正处于卵期，还未开始蛀蚀粮粒，所以对小麦水分含量的影响可以忽略不计。从感染的12 d到24 d，峰值比例P2b与P22的变化幅度最大，P22所占比例从9.81%上升到了33.05%，此阶段的玉米象孵化完成，从1龄幼虫长成4龄幼虫，在小麦体内活跃度增强，体积不断变大，所以通过LF-NMR检测显示虫峰信号逐渐增强，所占比例逐渐增加。从感染的24 d到30 d，峰值比例P2b与P22表现的非常平稳，P22所占比例都维持在31%以上，此时的玉米象正处于蛹期变态过程，虫体在小麦体内保持静止状态，不取食粮粒。待其逐渐长成成虫，由于成虫水分含量相较于幼虫与蛹期水分含量有所降低，因此峰值比例P22略有下降。在感染的36 d，成虫羽化而出，此时的蛀空粮粒P2b急剧上升，P22急剧下降。

图3 玉米象在小麦体内生长发育过程的峰比例P2b和P22的变化情况

3 讨论与结论

本研究通过高清软X射线拍摄的被玉米象感染小麦图片，可以清楚看到玉米象在小麦内部生长发育的全部过程，并能观察到在12%水分含量小麦中，玉米象在12 d左右孵化完成，整个玉米象的生长周期大约为36 d。

通过提取不同虫态玉米象感染小麦的纹理特征，利用LDA与QDA进行分类判别，两者都可以对未感染小麦与不同感染阶段小麦进行分类，对未感染小麦的分类准确率都在90%以上，并且对未感染小麦与不同感染阶段小麦进行单独分类判别时，准确率都达到了95%以上，尤其是未感染小麦与受卵期感染小麦的分类准确率要比先前的研究高很多，例如Chelladura等[7]利用LDA与QDA分类模型研究未感染大豆与受四纹豆象卵期感染大豆的判别准确率大约为60%，较之于Karunakaran等[5]的研究，本文增加了对玉米象卵期的检测。对玉米象卵期及幼虫阶段较高的判别准确率表明高清软X射线有可能实现隐蔽性害虫玉米象的早期检出。

结合高清软X射线拍摄的图片进行低场核磁检测，根据玉米象与小麦特征峰值比例的变化，能够判断小麦是否受到玉米象感染，并且处于哪一种虫态。因此能够将低场核磁检测技术引入储粮害虫检测领域，与高清软X射线相结合，以期为粮食隐蔽性害虫的早期检出提供一种新的思路与方法。