唐莹，周瑞生，黄海福，周岱翰

1.广州中医药大学肿瘤研究所，广东 广州 510006；2.广州中医药大学深圳医院，广东 深圳 518000；

1 研究背景

肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，亦是癌症患者死亡的首因[1，2]。尽管治疗肺癌的方法包括手术切除，放射治疗，化疗和靶向治疗正在进行中，5年肺癌的存活率仍处于较低水平[3]。各种生物标志物已在运用于肺癌的评估[4，5]。然而，很少有标记物被批准用于临床。因此，目前迫切需要寻找新的临床生物标志物来评估肺癌。

近年来，中药治疗肺癌取得了显著的疗效，抗肿瘤中成药毒副作用少、临床应用广、提高免疫能力明显，减少并发症，延长患者生命，甚至可以使患者实现“带瘤生存”的状态，中药在抗肿瘤用药治疗中占有重要地位。肺癌病机为本虚标实，与“虚、毒、痰、瘀”有关。本虚主要指肺虚、脾虚，日久伤肾，标实则痰、瘀作祟。中医认为脾胃为后天之本，李中梓提出“脾为生痰之源，肺为贮痰之器”，按照五行相生理论，肺属金，脾属土，土生金，补脾土即生肺金。肺癌多因痰湿作祟，痰湿阻碍气机，进而产生瘀血，因此健脾除痰是中医治疗肺癌的常用治法之一[6，7]。周岱翰等[8]将肺癌分为按肺郁痰瘀、脾虚痰湿、阴虚痰热、气阴两虚4型。刘嘉湘等[9]将肺癌分为气阴两虚、阴虚内热、脾虚痰湿、阴阳两虚及气滞血瘀5型。王少墨等[10]对国内公开发表的67篇中医药治疗原发支气管肺癌的临床报道进行了用药频次的统计分析结果表明：中医药治疗肺癌中，使用补气10味，使用率83%，使用化痰药15味，使用率66%；健脾化痰药使用频率较高，其中半夏、茯苓、白术、薏苡仁、陈皮、贝母和党参等健脾药及理气药的使用频率分别为100%、100%、86%、71%、86%、43%和71%。

中医强调整体观念和辨证论治。中医中的“证”是诊治疾病的基础，是疾病某阶段的高度概括。目前，中医“证”的确定很大程度上依赖于医生的临床经验，这使得“证”的可靠性和准确性受到限制。近年来很多学者尝试从生化、生理、超微结构等方面对“证”进行研究。但中医学证候并不是几个理化指标可以代替的，我们更多的是需要了解各指标间的网络联系[11]。临床中医证型主要是靠医生主观判断，很难标准量化。现代中医药现代研究应用需要对内涵进行研究和阐述，制定统一的、科学的判断标准。

蛋白组学技术强调把人作为一个完整的系统来研究，多采用“自上而下”的研究方式，通过高通量的筛选差异表达的蛋白质，从整体上展示生物体内在的变化状态，避免了以往采用单一指标或少数几个指标研究某种病理和生理变化[12]。蛋白质组学倾向于受内外因扰动后生物学事件的最终结果，因而更能够准确反映机体的状态。中医理论亦强调即时性和动态性。人和自然是相统一的，四时气候的变化、昼夜变化对疾病也有一定的影响。而蛋白质学描述的是生物体内蛋白质的表达随时间为参数的变化，在不同的时间，蛋白质的种类、浓度及比例是变化的。蛋白质组学以时间为参数与中医学的即时性和动态性是十分吻合的。

辨证分型是中医药治疗的核心。目前对脾虚痰湿证的辨证则依然停留在依靠中医四诊资料综合分析判断，不可避免有主观因素影响，尚缺乏较为公认的客观指标。目前对肺癌的辨证分型尚无统一标准，因此，在辨证论治过程中难免出现证候概念命名和证候辨证标准不统一。近年，有研究从理论和现代技术方面，试图探讨中医辨证分型的分子基础，期望从生物信息比较分析中实现微观辨证分型。晏雪生等[13]通过蛋白芯片技术证实了中医虚实证候与肺癌患者多项肿瘤标志物的表达密切相关。郎笑梅等[14]研究证实，痰瘀证组与正常对照组之间检测到18种差异蛋白（P＜0.05）。谭秦湘[15]应用蛋白质组技术，通过对正常组与肝郁证组血清蛋白质图谱的比较，发现12个差异蛋白质点，为从整体上探讨肝郁证特有蛋白质的表达，研究揭示了肝郁证候的重要相关蛋白质特性。蛋白质组学在肺癌发病机制、早期诊断、病理分型、鉴别诊断、预后与疗效监测研究积累了较多研究基础，目前主要集中在早期诊断方面。大量的研究采用了2-DE技术来鉴别肿瘤组织与正常组织间的差异蛋白[16-21]。

临床上中医证型主要是靠医生主观判断，影响了证候判断的可靠性和准确性。蛋白质是机体生物功能的最终执行分子，蛋白质组学时代的到来，为中医药现代化发展带来新的契机。已有学者借助此技术对肺癌的诊断、预后、疗效等做了大量研究，也在中医临床辨证分型及证本质研究中取得了一定成绩。本研究试图应用蛋白质组技术分析肺癌脾虚痰湿证与肺癌其他证型差异表达的蛋白质，阐明肺癌脾虚痰湿证“病-证”对应的物质基础，明确评价肺癌脾虚痰湿证客观、标准的指标，为肺癌辨证分型提供新的认知视角。

2 材料与方法

2.1 材料及仪器

碳酸氢钠、硫脲、碳酸钠、除高峰度蛋白试剂盒购自美国Sigma公司，Tris碱、尿素、二硫苏糖醇、3-[3-（胆酰胺基丙基）二甲氨基]丙磺酸盐、溴酚蓝、甘油、十二烷基磺酸钠、亚甲基丙烯酰胺、四甲基乙二胺、过硫酸铵、丙烯酰胺、低熔点琼脂糖、IPG buffer、蛋白质纯化试剂盒、固相pH值干胶条、定量试剂盒均购自瑞典Amersham Biosciences公司；丁醇、冰醋酸为德国Merck公司产品，无尘擦拭纸购自美国Kimberly Clark公司。DU730型核酸/蛋白分析仪（美国 Beckman）；IPGphor III等电聚焦仪，Ettan DALT six大型垂直电泳系统、扫描仪Typhoon9400和DeCyder V6.0分析软件（Amersham Biosciences）；质谱仪Ultraflex III（美国布鲁克）；制冰机（意大利Scotsman）；多维轨道摇床（美国）；小型台式离心机（德国Eppendorf）；排风柜（美国 Fisher）。

2.2 病人的选择

脾虚痰湿证辨证标准：

四诊合参，由两名经过统一培训的资深中医医师分别单独进行中医辨证，根据周岱翰教授提出的肺癌脾虚痰湿型个体辨证标准及积分表，将脾虚证、痰湿证的主要症状及次要症状按照程度不同进行评分，优化入选条件。

临床表现：咳嗽，痰多，胸闷气短，疲倦乏力，少气懒言，面色萎黄或苍白，形体消瘦或肢体浮肿，食少，腹胀，大便溏。

舌脉象：舌淡胖，或舌边有齿印，苔白或腻，脉濡或缓或滑。

本研究按照纳入排除标准选取3例肺癌脾虚痰湿型患者及3例正常人，患者均来自广州中医药大学第一附属医院。各组取得血浆组织，速冻存于液氮中，再置于-80℃保存，备双向电泳及质谱分析用。

2.3 碘比色法测定脾虚患者sAA活性

2.3.1 唾液测量体积与PH值后，离心机10 000 rpm离心5 min，上清取出进行活性测定。

2.3.2 活性测定

取唾液上清液0.1 mL置于50 mL的定容瓶，加蒸馏水定容，即得稀释50倍的唾液标本，采用碘比色法进行sAA活性测定。酶活性单位定义：1mL唾液在37℃中保温15 min，在实验条件下水解1mg淀粉至遇碘不呈蓝色为1单位（U）。

2.4 比色法测定脾虚患者尿液中D-木糖排泄率

2.4.1 样品采集：受试者于试验前一天晚上10时至第二天早晨试验结束前完全禁食但可以喝水；试验当天清晨先排空尿液后空腹口服D-木糖5.0 g（溶于300 ml温开水）。口服木糖后2小时内不再进食，收集口服D-木糖后2小时内的全部尿液，测量尿液总量。准确量记尿液总量后，留10-20 ml尿液（加3-5滴6 mol/L盐酸防腐，4℃保存，当天内测定）。

2.4.2 标准曲线的构建

分别精确量取D-木糖标准溶液0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL置于10 mL容量瓶中，然后加入已配制好的饱和苯甲酸溶液的上清液稀释至刻度，从而配成浓度分别为0.025 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1的溶液备用。分别从5个容量瓶中量取D-木糖标准溶液1 mL，然后加入对溴苯胺试剂5 mL混匀，并置于70℃的恒温水浴锅中保温10 min后再取出室温放置70 min。以0号为空白校正光密度到零点（0号为饱和苯甲酸上清液1 mL加对溴苯胺试剂5 mL），立即使用紫外分光光度计在520 nm波长处测定吸光度值并记录下来。将2小时所留尿液样品用蒸馏水稀释10倍，平行取稀释好的样品3份，各取1 mL，再加入对溴苯胺试剂5 mL，混匀后置于70℃恒温水浴锅中保温10 min，取出室温放置70 min后，以对照管为空白调零（对照管为蒸馏水1 mL加对溴苯胺试剂5 mL），立即测定吸光度值（OD值），以标准曲线推算出相应的尿液D-木糖浓度。

2.5 双向电泳及质谱分析

2.5.1 组织总蛋白的抽提及蛋白质浓度测定

血清12 000 r/min，4℃离心30 min，吸取上清入EP管，用50 mmol/L氢氧化钠调节pH值至8.5，取5 μl用于蛋白质浓度测定，其余上清置于-70℃保存备用。采用2D Quant Kit蛋白质定量试剂盒测定总蛋白浓度，其操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，绘制标准曲线，计算直线回归方程。

2.5.2 蛋白质荧光染料标记

每组蛋白质均取25 μg等量混合作为内标，50 μg内标蛋白用400 pmol Cy2进行标记，分别以50 μg蛋白每400 pmol Cy3和400 pmol Cy5标记，冰上避光放置30 min，再加1 μl亮氨酸（10 mmol/L）中止反应10 min。

2.5.3 2D-DIGE分析胶电泳和图像扫描

50 μgCy2，Cy3和Cy5标记的样品进行混合，加等体积的2×样品缓冲液，再加适量水化液补至总体积450 μl，上样，30V水化13h，然后经过100 V 0.5 h、500 V 0.5 h、1 000 V 1 h、5 000 V 1 h，最后稳定在8 000 V下进行等电聚焦8.5 h。一向电泳完后，取出IPG胶条先后置入平衡A液和平衡B中各平衡15 min。平衡后的胶条移至浓度12.5%PAGE分离胶上端用0.5%琼脂糖封胶，2.5 W电泳30 min，然后以11 W恒功率电泳，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底边处停止电泳。整个过程均避光操作。双向电泳完后，胶条取出擦洗干净，轻置Typhoon扫描仪，以Cy3，Cy2，Cy5设置进行扫描获得分析使用的凝胶图像。另外，还需制作一块制备胶，步骤同2D-DIGE，其上样为1 000 μg内标蛋白，电泳后考马斯亮蓝进行染色，用于差异蛋白的质谱鉴定。

2.5.4 图像采集分析和质谱分析

2D-DIGE分析胶图像用DeCyder 5.0软件进行分析。首先对每一张胶图上的所有蛋白质点扫描进行胶内分析（differential in-gel analysis，DIA），对不同胶的同一个蛋白质点与内标匹配，每个点的容积（背景删减后）、面积、峰值均被检测，计算每组（Cy3/Cy2，Cy5/Cy2）成像的标准丰度比值，然后对不同胶上的同一个蛋白质点与内标匹配，进行胶间分析（biological variation analysis，BVA），对匹配后每个蛋白质点的相对量进行比较分析后确定差异蛋白，筛选分析图像出现并比率≥1.5，P≤0.05的差异点。在制备胶上找到与分析胶上的差异点匹配的质点，取点，脱色，酶解及样品萃取，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术进行检测，获取PMF肽指纹图谱及PKL文件，在NCBInr蛋白质数据库中进行蛋白质匹配。

2.5.5 MALDI-TOF-TOF分析

使用德国Bruker公司的Ultraflex III质谱仪进行分析：1级质谱：反射模式，离子源加速电压1为24 kv，加速电压2为22kv，离子延迟提取0.000 ns，真空度1.4x10-7Torr，正离子谱测定，测定范围控制在700-4 000，获得样品的肽质量指纹图谱，胰酶自降解峰和污染物质的峰自动剔除；接着利用LIFT软件将PMF强度最大的4个峰（SN＞20）进行串级质谱分析。所获得图谱使用Biotools软件检索，以 MASCOT（Matrix Science，London，UK）为搜索引擎。搜索参数设置：数据库为SwissProt；检索种属为human；数据检索的方式为combined；最大允许漏切位点为1；酶为胰蛋白酶。质量误差范围设置：PMF75ppm，MS/MS0.5Da.

3 结果

3.1 碘比色法测定脾虚患者sAA活性测定

由表2可发现脾虚患者酸刺激后sAA较酸刺激后下降，而正常人酸刺激后其sAA是升高的，符合脾虚患者sAA变化。但是酸刺激前后sAA变化并不明显。

计算公式：AMY=（对照管吸光度-测定管吸光度）×2/10×30/7.5×100/0.1

表1 酸刺激前后OD值

表2 酸刺激前后sAA活性

3.2 比色法测定脾虚患者尿液中D-木糖排泄率

3.2.1 标准曲线

测定结果见表3。以吸光度值为Y轴、D-木糖浓度为X轴，构建回归曲线方程。得出线性回归方程为：Y=1.518 2 X+0.025 2，R2=0.989 2。

表3 线性关系考察结果

3.2.2 根据线性回归方程推算出尿液的D-木糖浓度见表4，再根据计算公式获得其相应的D-木糖排泄率见表5。计算公式如下：

尿木糖含量（mg）＝尿液D-木糖浓度×2小时尿总量（L）×稀释倍数

尿木糖吸收率＝{尿木糖含量（mg）/5000（mg）}×100%

表5表明：患者尿D-木糖排泄率与按文献报道的健康志愿者有所降低，患者肠道吸收功能显著低下，试验结果支持临床脾虚证的诊断。

3.3 双向电泳结果

通过2D-DIGE分辨来自脾虚痰湿型与非脾虚痰湿型肺癌患者血清的蛋白质。使用DeCyder软件分析图像。通过DeCyder软件分析，在所有6个样本的蛋白质点图谱中，与健康人相比≥1.5；p≤0.05，有7个蛋白质位点有显着表达差异。

表4 尿D-木糖浓度

表5 尿D-木糖排泄率

3.4 MALDI-TOF-MS结果

从制备凝胶中切下所有差异蛋白质位点，用胰蛋白酶原位消化并通过MS分析。MALDI-TOFMS分析和数据库匹配确定了7个位点作为相应的蛋白质，并且斑点具有高序列覆盖度和质量准确度。427位点代表蛋白质K1C10，428位点代表蛋白质NFM，991位点代表蛋白质HP，1130位点代表蛋白质WDR5，1481位点代表蛋白质APOA1，1499位斑点代表蛋白质SMS2，1564位点代表蛋白质SAMD14（表6）。

3.5 差异蛋白的功能分析

使用FunRich软件分析肺癌脾虚痰湿证的7个差异分子，其分子功能主要为：结合组蛋白，结构分子、运输和连接酶活性（图1）。生物学过程主要为：参与细胞生长/维持，免疫反应，运输，细胞通讯以及信号转导作用（图2）。生物途径中起重要作用：鞘磷脂代谢，ABCA转运蛋白在脂质体内平衡，脂质和脂蛋白的代谢，昼夜节律通路，高密度脂蛋白介导的脂质转运，乳糜微粒介导的脂质转运（图3）。

4 讨论

明代医家李中梓指出，“脾为生痰之源，肺为贮痰之器”。中医辨证及临床研究证实脾虚痰湿证是肺癌的主要证型，健脾除痰方药治疗本证得较好疗效。既往从生化、生理、免疫、细胞增殖与凋亡、信号转导等来探讨脾虚痰湿证应用健脾除痰法防治肺癌的机理，辨证则依四诊资料综合分析，缺乏较为公认的客观指标[22]。本研究通过碘比色法测定脾虚患者sAA活性及尿液中D-木糖排泄率测定，进一步确认了脾虚痰湿的证型。碘比色法发现脾虚患者酸刺激后sAA较酸刺激后下降，而正常人酸刺激后其sAA是升高的，符合脾虚患者sAA变化。但是酸刺激前后sAA变化并不明显，考虑如下可能：1.试剂质量影响检测结果；2.测量方法需要进一步优化；3.肿瘤及放化疗治疗对SAA的影响。

表6 肺癌脾虚痰湿证的7个差异蛋白

图1 差异蛋白的分子功能分析

图2 差异蛋白的生物学过程分析

图3 差异蛋白的生物学通路分析

通过对蛋白质组的技术分析得到7个与肺癌脾虚痰湿证相关的蛋白。KRT10是I型（酸性）细胞角蛋白家族的成员。KRT10和KRTl角蛋白在分化层的角质形成细胞内配对表达，它们以异二聚合体形式组装成细胞中间丝，这些丝状体连同肌动蛋白微丝和微管共同构成上皮细胞的细胞骨架，在保护机体对于外界温度及机械刺激的抵御方面起重要作用。目前KRT10在肺癌细胞中的作用机制研究较少。其在肺癌发生发展过程中的具体作用机制，仍需进一步研究证实[23]。NEFM由神经纤维细丝、最丰富的中间纤维在神经系统。NEFM除了在神经元细胞骨架中起结构作用外，在突触密度中还具有特殊的生物学功能。目前其与肺癌的关系尚未见报道，其具体作用机制仍需进一步研究[24]。HP，是一种酸性糖蛋白，主要作用是结合游离的血红素，防止铁和血红蛋白自肾脏流失，减少对肾脏的损伤。研究表明HP在肺癌患者血清中显著增高。在非小细胞肺癌早期血清结合珠蛋白浓度即明显升高，且血清结合珠蛋白浓度随着非小细胞肺癌分期的增高而增高，因此HP可作为非小细胞肺癌的筛查、诊断及预测分期的辅助指标。另外在晚期非小细胞肺癌疗效的评估中也具有指导意义[25]。WDR5是WD40蛋白家族的成员之一，同时也是染色体H3修饰蛋白复合体Trithorax group（TrxG）的重要组分之一，能降低染色体的折叠，促进染色体的开放，而促进对应基因的表达。研究发现WDR5与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关[26]。ApoA-I属于载脂蛋白A1/A4/E家族成员，在肝脏和小肠中合成的，这种蛋白质的功能包括将组织中的胆固醇反向运输到肝脏进行排泄，转移脂肪酸和乙醇胺返回细胞进行再利用，作为卵磷脂胆固醇酰基转移酶的辅助因子（LCAT）将胆固醇转化为胆固醇酯（CE）。有研究表明，在ApoA-I和癌症之间。在乳腺癌中，ApoA-I数值较低与更高的癌症风险相关，特别是复发。ApoA-I的低水平也可视为是早期胰腺癌和卵巢癌的预测指标[27]。鞘磷脂合酶（SGMS）是一种神经递质酶调节神经酰胺合成鞘磷脂（Cer）4。虽然SGMS有三个同系物，即SGMS1、SGMS2和sgms相关蛋白（SGMSr），只有SGMS1和SGMS2促进SM合成，而SGMSr促进SM类似物的合成神经酰胺phosphoethanolamine5。Cer在其中起着至关重要的作用细胞凋亡的调控。之前的一项研究确定SGMS2的上调显著降低了表达Cer，导致细胞异常凋亡活性，从而促进细胞增殖。我们的发现表明SGMS2-mediated TGF-β/Smad的激活信号通路在乳腺癌进展中起着重要作用[28]。SAMD14为近年来发现的一种抑癌基因，位于17q21.33染色体上，其5'端上游有PDK2（pyruvate dehydrogenase kinase 2）基因，3'端下游有Neurabin-2基因。SAMD14编码蛋白由417个氨基酸组成，参与细胞发育等多种细胞功能调控。研究表明SAMD14启动子区有68%的CG。在小鼠肺癌样本中，研究发现SAMD14启动子区CpG岛存在异常高甲基化。鼠SAMD14与人的基因同源，人肺癌样本中亦检测到其表达下调，该基因启动子区域也呈现异常高甲基化修饰。在使用甲基化抑制剂处理A549后，SAMD14的表达恢复。该结果提示SAMD14启动子区的高甲基化修饰与其表达的沉默有关，即其启动子区的高甲基化至少是SAMD14表达下调的原因之一。还有报道显示，SAMD14也可参与血液系统造血功能调控，它的其余功能尚不清楚[29]。

通过对差异蛋白的分子功能分析发现，脾虚痰湿型肺癌与免疫系统密切相关。正常情况下，免疫系统可以识别并清除肿瘤微环境中的肿瘤细胞，但为了生存和生长，肿瘤细胞能够采用不同策略，使人体的免疫系统受到抑制，不能正常的杀伤肿瘤细胞，从而在抗肿瘤免疫应答的各阶段得以幸存。肿瘤的这种免疫逃逸是肿瘤的获得性特征之一，目前免疫相关的抗癌策略是一个很有前景的挑战，并为成功对抗脾虚痰湿型肺癌提供了希望。

5 小结

中医与现代分子生物学的结合使中医理论更加科学、规范。蛋白质组研究从整体水平反映疾病过程中蛋白质表达的动态演变，与中医“整体观念”及“辨证论治”的认识极相似。本研究应用蛋白质组技术分析肺癌脾虚痰湿证与肺癌其他证型差异表达的蛋白质进行分析，探索肺癌脾虚痰湿证“病-证”相关物质基础及诊断、鉴别诊断客观指标。本研究证实了肺癌脾虚痰湿证与人体的免疫及代谢系统密切相关，为今后的研究提供了新的思路，然而本研究还有待进一步的实验验证。此外，7个差异蛋白是否可以解释脾虚痰湿证型的蛋白表达，7个差异蛋白在其他肿瘤的脾虚痰湿证中是否也有表达变化，肺癌脾虚痰湿证与肺癌非脾虚痰湿证患者的蛋白表达差异，以上的问题以及对差异蛋白质和脾虚痰湿证型之间内部机制尚有待深入的研究。