郑玮璇 ，黄奔奔 ，俞涵曦 ，徐小萍 ，邵颜平 ，郭志鹏 ，何邱明，赖钟雄*，林玉玲*

（1.福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州 350002；2.福建盘古中药材有限公司，福建三明 365000）

黄精（Polygonatum sibiricum）属于百合科黄精属具肉质根状茎的多年生药用草本植物，俗称老虎姜、鸡头参、野山姜，以根茎入药，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾功能。黄精的主要功能成分是多糖、皂苷和黄酮。多糖具有抗肿瘤、抗辐射、改善记忆、预防骨质疏松症等作用[1-2]；皂苷具有提高免疫力、延缓衰老等作用[3]；黄酮具有抗氧化、降血糖、调血脂、预防动脉粥样硬化等作用[4]。黄精为兼具食用、药用和观赏价值的经济植物，具有广阔的开发利用前景。福建是黄精的产地之一，三明市是福建道地中药材的主要产区之一。三明黄精样本中多糖含量已经超过了《中国药典》[5]中黄精合格含量的3倍之多，药效更足。黄精产业在健康大背景下后市看好，但产业发展存在资源枯竭且质量不稳定、人工栽培种质混乱技术滞后、功效物质基础不明确等问题[6]，急需加强对其繁育技术和核心功效物质的基础研究。

黄精的繁殖方式主要有有性繁殖（种子繁殖）和无性繁殖（块茎繁殖）2种。由于黄精种子难收集，种子发芽率低，而且种子繁殖育苗时间长，种子繁殖至少5年以上才能收获[7]，这样就大大增加了黄精的栽培成本，不利于黄精的人工大面积种植。在当前的人工栽培中，黄精繁殖主要依靠根茎的无性繁殖，但该方法繁殖系数低，种根茎用量大，既不经济，又限制了黄精的产量潜力，不便栽植管理推广[8]。仅靠野生资源来生产药品远不能满足整个医药市场的需求。因此，建立更加高效的组织培养快繁体系是目前黄精快速繁殖的重要突破口。

增殖和生根培养是黄精组织培养的难点，是实现工厂化、规模化育苗的关键技术。关于同属植物多花黄精（P.cyrtonema）的增殖和生根体系已有不少研究。徐忠传等[9]的研究表明，6-BA对黄精不定芽增殖起显著促进作用，是目前较为常用的芽增殖植物生长调节剂。通过许丽萍等[10]的研究可知，仅单独使用6-BA也能达到较好的增殖效果，60 d左右增殖系数超过3。程强强等[11]研究发现，TDZ有利于多花黄精不定芽增殖，但不定芽生长较慢，继代1个月的增殖苗仍不能用于生根。6-BA与TDZ组合培养，虽然可缩短生根时间，但增殖效率不高，需要进一步优化激素配比。刘红美等[12]和李莺等[13]分别对多花和鸡头黄精生根条件进行探索，发现最佳生根培养基均为1/2 MS+0.7 mg/L IBA，生根率为90%以上，有效解决了黄精组培快繁中生根率低的问题。李文金等[14]以泰山多花黄精试管苗为试验材料，发现最佳生根条件为1/2MS+0.5 mg/L NAA+蔗糖20g/L+暗培养7 d，生根率高达96%。周新华等[15]对多花黄精生根培养条件进行研究，结果显示多花黄精生根的最适基本培养基为1/2MS培养基，不同种类生长素对不定根的诱导能力的强弱依次为NAA＞IBA＞IAA，多花黄精组培苗的最适生根培养基为1/2MS+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，生根率为95%。这些均为该次试验设计提供了参考依据。目前尚未见到关于福建三明野生黄精增殖体系和生根体系的报道，该研究以福建三明野生黄精为材料，建立高效不定芽增殖和生根体系，以期为工厂化、规模化的三明野生黄精育苗提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料来源于福建盘古中药材有限公司收集种植的福建三明野生黄精。于2017年12月及2018年4—5月挖出，后移至福建农林大学园艺植物生物工程研究所，埋藏于栽培基质中。参考实验室吕煜梦等建立的无菌体系进行消毒试验（待发表，三明野生黄精无菌体系的建立与不定芽的诱导），将黄精块茎从基质中挖出，洗去泥土。剪去叶片和须根，用牙刷或毛刷清洗表面基质土，用洗衣粉溶液浸泡，在流水下冲洗3 h，3%多菌灵浸泡2 d后用清水洗去表面多菌灵，然后晾干。在超净台用无菌水清洗1～2遍，取出块茎于滤纸晾干，在接种盘中将块茎根据节间长度切成小块，较大的块茎适当切小些。用体积分数75%乙醇进行表面消毒30 s，无菌水清洗1～2次；用0.2%升汞进行深度灭菌15min，同时滴1滴吐温；无菌水清洗4～5次。

将消毒后的块茎在MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂的培养基上进行不定芽诱导，选择生长健壮的无菌带芽块茎作为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 不定芽增殖。将芽诱导试验得到的无菌带芽块茎切成直径0.5 cm大小的丛生芽块，切除块茎底部发黑褐化的部分以及部分叶片和苞衣后转接到增殖培养基上。培养基为：（1）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D；（2）MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L IAA；（3）MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L2，4-D；（4）MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L2，4-D+0.5 mg/L IAA。以上4种培养基均添加30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂，pH 5.8。30 d后观察并统计芽增殖系数。

1.2.2 生根试验。将丛生芽切开，保留叶片，分成单株，分别接种在添加不同浓度生长素NAA（0.2～1.0 mg/L）和IBA（0.2～1.0 mg/L）生根培养基上，3种培养基均添加30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂，pH 5.8。每瓶接种6个块茎，每个处理接种10瓶，45 d统计生根率，平均根数。

1.2.3 培养条件。培养室温度控制在（25±2）℃，光照强度为1 500～2 000 lx，每天光照时间16 h。

2 结果与分析

2.1 不同植物生长调节剂处理对不定芽增殖的影响

以MS为基本培养基，在相同6-BA浓度的基础上添加不同浓度的IAA、2，4-D、TDZ对黄精带芽块茎进行培养，30 d后统计观察结果见表1。将无菌外植体接入增殖培养基后约15 d有启动趋势，出现突出的芽原基；培养25 d左右原有不定芽周围有大量新芽冒出，且其生长势逐渐增强，有效芽逐渐增多（图1）。由表1可知，在三明野生黄精增殖继代的过程中随着TDZ浓度的提高，不定芽增殖系数也相应提高。带芽黄精块茎在1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L IAA的培养基中增殖效果最好，增殖系数最高，为3.02，但芽点较细长，部分叶片发生不规则弯曲。

表1 不同植物生长调节剂组合对三明野生黄精不定芽增殖的影响

图1 三明野生黄精不定芽增殖情况

2.2 不同植物生长调节剂处理对组培苗生根的影响

以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的生长素（NAA、IBA），培养15 d可见基部有白色的根系，培养45 d后，统计生根情况，结果如表2所示。以NAA为主的激素处理比以IBA为主的激素处理生根率高；从根系形态上来看，NAA浓度高的处理根系较为粗壮，IBA浓度高的处理根系较细弱。在IBA浓度相同的情况下，随着NAA浓度的升高生根率呈上升趋势。结果表明NAA诱导三明野生黄精生根的效果比IBA好，1/2MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA生根率最高，为73.3%，但根数少，幼苗生长势弱，不利于移栽成活。1/2MS+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA生根率高，平均根数多，但同样存在幼苗生长势弱的问题。综合考虑，1/2MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA为最适生根培养基，生根率为65.0%，平均生根数为7.67条，芽苗健壮（图 2）。

表2 不同植物生长调节剂组合对三明野生黄精生根的影响

图2 1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA诱导的三明野生黄精不定根

3 讨论

3.1 TDZ对不定芽增殖有显著促进作用

影响植物离体培养的因素有很多，包括外植体的品种、生理状态、激素配比等。TDZ是一种高活性细胞分裂素，常用于木本植物组织培养[16]。TDZ能强烈促进愈伤组织、侧芽及不定芽的发生，在许多植物芽增殖过程中有良好的效果[17-18]。三明野生黄精芽增殖试验中发现，处理3（1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D）和处理 4（1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L IAA） 的增殖系数显著高于其他处理，可能由于TDZ对黄精芽增殖有较好的促进效果。徐红梅等[19]研究发现，TDZ促进多花黄精芽增殖的效果优于6-BA处理，但对叶片生长不利，会导致畸形叶片的产生。这与该次试验的结果相似，部分叶片出现不规则弯曲，叶片较为细长。为了保持叶片正常形态，增殖培养后期应将丛生芽块转接到不含TDZ的培养基继续培养，诱导叶片正常生长。处理 1（1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D）与处理2（1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L IAA）相比增殖效果更佳，可能由于该处理生长素浓度过高，对芽增殖产生抑制作用[20]。处理4的增殖效果优于处理3，表明IAA和2，4-D一起处理增殖效果优于单独使用2，4-D。

3.2 NAA比IBA更有利于三明野生黄精生根

生长素能促进外植体生根。生长素IBA、NAA被广泛应用于黄精及多花黄精生根诱导，如0.8～1.0 mg/L NAA[11，21]、0.7～1.0 mg/L IBA[12，22]为各报道中最佳的生根激素配比。在前期试验中发现，低浓度生长素如0.5 mg/L NAA、0.7 mg/L IBA处理下生根启动慢、生根率极低，推测三明野生黄精需要较高浓度的生长素处理。试验过程中发现三明野生黄精生根较为困难，这可能与三明野生黄精本身生根性质有关。后期参考现有生根报道设计了8个处理，结果显示NAA比IBA更适合诱导三明野生黄精生根，单独使用1.0 mg/L IBA、NAA处理，1.0 mg/L NAA的生根率明显高于1.0 mg/L IBA的处理。在1.0 mg/L NAA的基础上添加一定浓度IBA对不定根的诱导有显著促进作用。1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA是生根效果最佳的组合，生根率为70.0%，平均生根数6.62，但幼苗长势弱，不利于移栽成活。综合考虑，1/2MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA为生根培养最适培养基。

综上所述，三明野生黄精最佳芽增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L IAA，30 d增殖系数达3.02；最适生根培养基为1/2MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA，生根率为65.0%，平均根数7.67。该研究可为三明野生黄精规模化生产提供技术依据。