黄桂锋，郑晓虹，麦喆钘，杨诏钧，林雪莹，李俊哲（.汕头市潮阳区大峰医院心血管内科，广东汕头5500；.广州中医药大学第二临床医学院，广州 50405；.广州中医药大学第一临床医学院，广州50405）

随着社会经济的发展和人们生活质量的提高，高脂、高糖的饮食习惯日渐普遍，导致冠状动脉粥样硬化性心脏病（以下简称“冠心病”，CHD）的发病率和病死率逐年增加，已严重影响到人们的生活质量[1]。CHD指冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，病情严重可导致患者猝死[2-3]。CHD在临床的药物治疗思路主要包括抗血小板聚集、调脂、扩张冠脉、减轻心肌耗氧量、改善心脏重构等[4-6]。目前，随着中医药的蓬勃发展，中药在辅助治疗CHD方面发挥了重要作用。本研究团队发现，临床上采用血栓通注射液或胶囊联合常规药物治疗CHD往往可以取得更好的疗效[7-8]。而血栓通相关制剂的主要药味均为三七[9-10]，因此本研究团队认为三七在CHD治疗过程中可发挥巨大的作用。现代药理学研究也证实，三七总皂苷可改善能量代谢障碍，促进受损组织对能量物质的利用，有利于组织结构和功能的恢复；有利于清除自由基和抗氧化应激，减少细胞损伤；能调控细胞凋亡信号通路，明显减少心肌细胞凋亡，可在一定程度上减少CHD诱因的产生，从而降低CHD的发生风险[11-12]。三七化学成分复杂，对相关疾病的治疗具有多成分、多靶点、多途径等特点，但是目前对其药理学研究仅停留在单成分研究或其对某种动物模型和某个/某几个相关因子的影响，尚无法很好地解释其在治疗CHD中作用广泛、效果良好的特点，其化学活性成分和作用机制均不明确。

网络药理学是以系统生物学为基础，利用生物网络数据库、各种生物网络构建方法和生物网络分析技术，通过网络构建工具，系统阐述“药物-基因-靶点-疾病”之间复杂网络关系的一门交叉学科[13]。本研究应用网络药理学的方法，分析三七的化学成分、作用靶标、信号通路，并进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析以及基因本体（GO）分类富集分析，揭示三七的多靶标、多通路协同作用机制，旨在发掘其治疗CHD的新靶点和新通路，为临床治疗CHD提供新思路，同时也为三七的临床应用提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 三七活性成分的获取

利用中药系统药理学分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/）检索三七的化学成分。以“三七”为关键词在该平台进行检索，获得其化学成分的信息，包括分子名、分子量、脂水分配系数、半衰期、口服吸收度（OB）和类药性（DL）等。由于并非所有成分均能作为药物进入人体内发挥作用，所以根据TCMSP平台的推荐，选取同时满足“OB值大于30%”“DL值大于0.18”这两个纳入条件[14]的化学成分，作为三七的活性成分。

1.2 三七治疗CHD的作用靶标基因的获取

1.2.1 三七活性成分靶标基因的获取 采用Discovery Studio 4.0软件对“1.1”项下获取的三七活性成分进行预处理：选择“Minimize ligands”模块，选择“CHARMm”力场，能量优化算法采用“共轭梯度法”和“最陡下降法”，对活性成分进行能量最小化分析；分子多构象生成选择“BEST”模式进行。通过Chembiodraw Ultra 12.0软件绘制三七活性成分的3D结构图，然后将所有活性分子的3D结构上传到DRAR-CPI服务器（http：//cpi.bio-x.cn/drar/），并基于反向分子对接方法对活性成分和靶标间相互作用的亲和性进行评分。按照该服务器推荐，选定Z-score值小于－0.5的蛋白[15]作为三七活性成分的靶标蛋白，并记录活性成分和靶标蛋白的对应关系。然后通过UniProtKB数据库（https：//www.uniprot.org/）检索活性成分靶标蛋白的分子名，检索字段为“All Fields”，限定物种为“Human”，从而获取靶标蛋白的相应基因与其UNIPROTKB编号（UPID）。

1.2.2 CHD疾病靶标基因的获取 分别在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）和DisGeNET数据库（http：//www.disgenet.org/）中进行检索，以“Coronary heart disease”或“CHD”为关键词，获取CHD疾病靶标基因。

1.2.3 三七治疗CHD的成分-疾病靶标基因的获取采用Excel 2007软件录入三七活性成分靶标基因和CHD疾病靶标基因，对两者进行对比并筛选出交集基因，作为三七治疗CHD的成分-疾病靶标基因（简称为“作用靶标”）；同时，筛选出上述靶标基因对应的UPID。

1.3 有效成分-作用靶标基因网络的构建

根据“1.2.3”项下筛选获得的作用靶标基因，从“1.1”项下获取的三七活性成分中筛选出三七中可能具有CHD治疗作用的活性成分，作为有效成分。将这些有效成分和作用靶标基因及两者间的对应关系文件导入Cytoscape 3.6.0软件，构建有效成分-作用靶标基因网络，并对网络可视化图谱进行读取和分析。

1.4 核心靶标的获取

1.4.1 潜在核心靶标的获取 将“1.2.3”项下获得的三七治疗CHD的作用靶标基因的UPID导入String数据库（https：//string-db.org），限定物种条件为“Homo sapiens”，检索获取作用靶标基因的相互作用网络关系。再将这一相互作用网络关系文件导入Cytoscape 3.6.0软件，绘制作用靶标基因的相互作用网络。采用该软件的“Network Analyzer”工具对相互作用网络进行分析并计算各作用靶标的连接度（Degree）。Degree值代表某个靶标与其可能具有相互作用关系的其他靶标数量，该值越高则意味着该靶标在三七治疗CHD中发挥的作用可能越大。筛选Degree值最大的5个作用靶标作为潜在核心靶标。根据各个作用靶标的Degree值调整节点的面积大小，绘制作用靶标的相互作用网络图（Degree值越大则节点面积越大），并对图谱进行读取和分析。

1.4.2 潜在核心靶标与有效成分之间结合力的分子对接验证 将“1.4.1”项下获得的潜在核心靶标导入System Dock Web Site服务器（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index），按照服务器原始参数设定，将潜在核心靶标与“1.3”项下获得的三七治疗CHD的有效成分进行分子对接，得到对接评分（Docking score），用来评价有效成分与潜在核心靶标的结合力，以验证核心靶标的真实性。当对接评分＞4.25时，表示成分和靶标具有一定的结合能力；当对接评分＞5.0时，表示其结合能力较强；当对接评分＞7.0时，表示其结合能力很强[16]。

1.5 重要信号通路和分子功能的获取

将“1.2.3”项下获得的三七治疗CHD的作用靶标基因导入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），设置“Select Identifier”为“UNIPROT ACCESSION”、“List Type”为“Gene List”，选择“Functional Annotation Tool”，获得KEGG通路富集分析和GO分类富集分析的结果，并重点关注GO分类富集分析结果中的分子功能（Molecular function，MF）部分。选取P＜0.001[17]的信号通路和分子功能，并根据富集基因数由多到少排序，选取排名前20位的信号通路和分子功能，结合现有文献，从中筛选三七治疗CHD的重要信号通路和分子功能并进行分析。

1.6 重要信号通路的“有效成分-作用靶标-信号通路”网络构建

通过DAVID数据库，在筛选重要信号通路的同时，找出富集于上述信号通路中的作用靶标基因，并与“1.2.3”项下获得的三七治疗CHD的作用靶标基因进行对比，筛选出交集靶标。将这些交集靶标与“1.3”项下获得的三七治疗CHD的有效成分相配对，然后将配对关系文件导入Cytoscape 3.6.0软件，构建出重要信号通路的“有效成分-作用靶标-信号通路”的网络关系图，对图谱进行读取并分析三七治疗CHD的分子机制。

2 结果

2.1 三七活性成分的筛选结果

从TCMSP平台上检索到三七所含的化学成分有119个，符合纳入条件的活性成分共5个，分别为豆甾醇（Stigmasterol）、β-谷固醇（Beta-sitosterol）、人参皂苷rh2（Ginsenoside rh2）、槲皮素（Quercetin）、三七皂苷r1（Notoginsenoside r1），详见表1。

表1 三七活性成分Tab 1 Active components of Panax notoginseng

2.2 三七治疗CHD作用靶标基因的筛选结果

在DRAR-CPI服务器中对三七的5个活性成分进行反向分子对接后，结果Z-score值小于－0.5的靶标有147个；通过UniProtKB数据库获得其对应的基因和UPID；再将上述靶标基因与GeneCards和DisGeNET数据库中的CHD相关基因比对、取交集后，筛选出三七治疗CHD的作用靶标基因96个，详见表2。

2.3 有效成分-作用靶标网络的构建结果

根据作用靶标基因的筛选结果，从三七的5个活性成分中筛选出5个有效成分（见表1），即活性成分均为有效成分。经有效成分与作用靶标基因配对后绘制出有效成分-作用靶标基因网络图（见图1）。由图1可见，网络中共有101个节点，包括5个有效成分和96个作用靶标基因，其中矩形节点代表有效成分，圆形节点代表作用靶标基因；另有134条边线，代表5个有效成分与96个靶标基因之间存在134种作用关系，其中槲皮素可与83个靶标基因产生作用。由该网络可见，同一作用靶标基因可对应不同的有效成分，而同一有效成分也可以作用于不同的靶标基因，表明三七治疗CHD具有多成分、多靶标的特点。

表2 三七治疗CHD的作用靶标基因Tab 2 Target genes of P.notoginseng for CHD

图1 有效成分-作用靶标基因网络Fig 1 Effective component-target gene network

2.4 核心靶标的筛选结果

对通过String数据库获得的作用靶标的相互作用网络关系，绘制出靶标的相互作用网络图，结果见图2。由图2可见，该网络共包括96个节点、1 187条边线，其中圆形节点表示作用靶标，边线表示靶标之间的相互作用关系。经“Network Analyzer”工具计算得出各作用靶标的连接度，结果见表3。由表3可见，连接度最高的5个靶标分别为蛋白激酶B（AKT）、白细胞介素6（IL-6）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、c-JUN蛋白（c-JUN）、肝磷脂结合表皮生长因子（HB-EGF）。因此，本团队认为，上述5个靶标在三七治疗CHD中发挥了重要作用，为潜在核心靶标。结合图2亦可看出，上述5个作用靶标可影响多个靶标，进一步证实了三七治疗CHD不仅是通过作用于多个靶标而发挥多种效果，还通过靶标之间的相互作用产生了复杂的网络调节效果。

图2 作用靶标的相互作用网络Fig 2 Target interaction network

将5个潜在核心靶标与三七的5个有效成分进行分子对接验证后，结果在25种可能的对接关系中，有4种对接关系的对接评分＞7.0，占16%；有9种对接关系的对接评分在7.0～5.0之间，占36%；有9种对接关系的对接评分在5.0～4.25之间，占36%；有3种对接关系的对接评分＜4.25，占12%。由此可见，5个潜在核心靶标与三七的有效成分结合活性高，两者之间具有较强的结合能力。本团队认为，该5个靶标在实际情况中确实发挥了较大的作用，因此确定为三七治疗CHD的核心靶标。

2.5 重要信号通路和分子功能的筛选结果

经KEGG通路富集分析，符合筛选条件的信号通路有20条，详见表4；经GO分类富集分析，符合筛选条件的分子功能有20个，详见表5。结合已有文献及相关研究，本团队认为，在三七治疗CHD中发挥重要作用的通路有磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路、低氧诱导因子1（HIF-1）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路；作用较大的分子功能是蛋白结合（Protein binding）。

2.6 有效成分-作用靶标-信号通路网络构建结果

基于重要信号通路的筛选结果，构建出有效成分-作用靶标-信号通路网络图，详见图3。由图3可见，该网络共有49个节点，其中三角形节点为有效成分，圆形节点为作用靶标基因，六边形节点为重要信号通路。由该网络图可见，三七治疗CHD的机制主要是由5个有效成分作用于41个作用靶标，从而调控HIF-1、MAPK、PI3K/AKT信号通路，发挥抗炎、保护缺血损伤、减少动脉粥样硬化的作用。

表3 作用靶标的连接度Tab 3 Target connectivity

表4 作用靶标的KEGG通路富集分析结果Tab 4 Analysis results of KEGG pathway enrichment of target

表5 作用靶标的分子功能GO分类富集分析结果Tab 5 Analysis results of GO pathway enrichment for molecular function of target

图3 有效成分-作用靶标-信号通路网络Fig 3 Effective component-target-signaling pathway network

3 讨论

中药三七，其味甘、微苦，入足厥阴肝经，具有和营止血、通脉行瘀的功效，可用于各种血瘀证的治疗[18]。现代药理学研究发现，三七可有效治疗动脉粥样硬化，具有抗粥样硬化斑块形成、抗氧化、抗炎的作用，可抑制IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症因子的表达[19]。

由本研究获得的有效成分-作用靶标基因网络图可知，三七治疗CHD的有效成分分别为豆甾醇、β-谷固醇、人参皂苷rh2、槲皮素和三七皂苷r1。这5个有效成分可作用于96个作用靶标基因从而产生对CHD的治疗效果。其中，槲皮素可作用于83个靶标，可能在治疗中发挥了最广泛、最重要的作用。既有研究亦证明了槲皮素对于心血管疾病的治疗确实发挥了积极的作用：其可减少肥大心肌细胞中的蛋白浓度，减轻心肌肥大程度；可提高心肌细胞ATP水平和线粒体膜电位，降低活性氧簇（ROS）含量，从而改善心肌细胞线粒体代谢，改善心肌细胞能量代谢紊乱和凋亡，对于心肌细胞具有保护作用[20]。从本研究获得的有效成分-作用靶标基因网络图可知，三七可通过多成分作用于多靶标来治疗CHD。

由本研究获得的作用靶标相互作用网络图可知，三七治疗CHD的各作用靶标之间存在复杂的相互影响，这表明其作用机制复杂多样，不仅是某个成分作用于某个靶标产生的，还有靶标之间的相互影响。分子对接结果证实，核心靶标可与有效成分紧密结合，由此说明本研究对于核心靶标的预测与实际情况吻合度较高。结合相互作用网络图与分子对接结果，本研究团队认为，AKT、IL6、VEGFA、c-JUN、HB-EGF为核心靶标，可对多个其他靶标产生影响，可发挥多方面的、综合的治疗效果。这一推论也符合既有研究成果。AKT是PI3K通路中的一个重要蛋白，可调控细胞凋亡、增殖、抗氧化等多种反应[21]。韩军等[22]研究发现，金丝桃苷可使AKT磷酸化、激活，促使TNF-α和IL-6活性降低，减轻炎症反应，保护缺血再灌注损伤心肌。所以，本研究团队认为三七也可起到活化AKT、抑制炎症反应的作用。IL-6又被称为前炎症因子，可调控机体炎症发生，促进冠状动脉粥样硬化[23]。Scheller J等[24]研究发现，IL-6水平与冠状动脉严重病变的发生率呈正相关。郭旗等[25]也通过研究发现，随着CHD临床症状的加重，IL-6水平在依次递增。因此，本研究团队推测三七是通过抑制IL-6的生物学功能从而减轻CHD症状并减缓病情的进展，从而达到治疗目的。HB-EGF是表皮生长因子家族成员之一，参与多种生理病理过程，如心脏发育、心肌修复、心肌肥大等[26]。有研究证实，在动脉粥样硬化斑块组织中，HBEGF在主动脉血管平滑肌细胞和巨噬细胞中有明显高表达，能促进动脉硬化，加重CHD的临床症状[27]。对此，本研究团队考虑三七可能是通过降低HB-EGF的表达来减轻CHD的临床表现。c-JUN是激活蛋白1（AP-1）的异源二聚体形式，已有研究证实，c-JUN可诱导内皮细胞黏附因子产生、增加趋化因子表达和泡沫细胞生成，从而促进动脉粥样硬化的形成与发展[28]。因此，三七有可能通过抑制c-JUN的表达来发挥防治CHD的作用。VEGFA是血管内皮因子家族中的一种类型，与不同受体结合后可以激活不同的下游信号通路来发挥作用[29]，然而关于VEGFA在CHD治疗中的作用机制尚未明确，缺少相关研究。

从本研究的GO分类富集分析结果可知，三七可通过影响蛋白结合的功能以达到治疗CHD的目的。有研究发现，部分结合蛋白的大量合成可导致CHD发生率升高，例如血清视黄醇结合蛋白4（RBP4）在动脉粥样硬化组中分泌的增多，对CHD的发生起到一定诱导作用[30]；脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（AFABP）也是一种可诱发CHD的结合蛋白，其在巨噬细胞中是炎症反应的关键调节因子，可参与到动脉粥样硬化的过程中，是心血管疾病的炎症性危险因素[31]。因此，本研究团队推测三七可抑制蛋白结合功能，减少RBP4和AFABP等结合蛋白的合成分泌，达到防治CHD目的。

从本研究KEGG通路富集分析结果和有效成分-作用靶标-信号通路网络图可知，三七治疗CHD主要是通过调控PI3K/AKT信号通路、HIF-1信号通路和MAPK信号通路从而发挥作用。其中，PI3K/AKT信号通路在心肌细胞的凋亡、炎症反应、抗氧化反应中发挥着至关重要的作用[21]。研究表明，当心肌细胞受到损害时，PI3K/AKT信号通路可抑制心肌炎症反应的发生，限制内源性负反馈调节因子和代偿机制的产生，从而减少恶性病变的发生，保护受损心肌[32-33]。HIF-1是HIF-1信号通路中的重要因子，广泛存在于多细胞动物体内，在低氧状态下，机体可通过调节HIF-1信号通路来上调HIF-1的表达，从而维持内环境的氧稳态[34]。目前越来越多的研究致力于利用HIF-1α来调控多种血管生成因子的表达，由此对缺血缺氧的心肌组织进行基因治疗，达到促进新生血管的生成、改变靶组织代谢情况从而减轻心肌缺血损伤的目的[35]。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）是MAPK通路中的重要下游蛋白，作为细胞内信号传导酶，在心肌缺血再灌注损伤信号传导通路中发挥了重要作用[36]。张成哲等[37]研究发现，脾虚型CHD模型动物的p38 MAPK蛋白表达明显升高，猜测其可能通过激活核转录因子κB（NF-κB），进而诱导IL-6、TNF-α的释放，参与动脉粥样硬化的形成，导致CHD的发生。

综上所述，三七治疗CHD的过程涉及多个活性成分、作用靶标及通路，这与中医药治疗疾病“多成分、多靶标、多通路”的作用特点相符合。本研究所得结论大部分与现有研究报道相一致，但也有部分结论并无足够的既有相关研究支持，这可能是对数据进行多次交互分析产生的误差，但从另一个角度看也可为研究者提供该领域新的研究切入点。本文仅从理论层面研究了三七治疗CHD的作用机制，实际应用中还需要更多的临床试验和相关细胞、分子实验等对本结论进行验证。