邵天舒，周长明，余立，郭雷（北京市药品检验所中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京102206）

因来源和组分的复杂性，由动物组织器官提取制备的多组分生化药已成为备受学者关注的焦点和相关药品质量控制研究的热点[1]。小牛血去蛋白提取物是将新生小牛静脉血去除蛋白质后，经透析、浓缩、超滤等工艺制成的含有小分子多肽、氨基酸及无机元素等的混合物，该药主要用于脑缺血、痴呆、脑外伤及大脑功能不全等脑细胞代谢障碍性疾病的治疗[2]。目前，有关该药质量控制方面的研究主要为其活性组分如多肽、氨基酸以及钠钾离子的含量检测[3-4]，而对于其中元素控制方面尚无文献报道，且现行国家药品标准WS1-XG-029-2000和进口药品注册标准JX20030248中也未见对该药中元素控制的相关项目[5-6]。

近年来，随着环境污染日益严重，动物在养殖过程中的饮用水、饲料受到有害元素如汞（Hg）、铅（Pb）、砷（As）、镉（Cd）、铝（Al）等污染的概率也随之增加，且金属元素易与动物体内的多肽、蛋白质等成分螯合，使得金属元素在动物组织器官来源的药物中形成残留[7]。过量的Hg可危害人体中枢神经系统，As则会影响细胞代谢，Pb对神经系统、消化系统和造血系统都有毒性作用，Cd中毒可能会导致肾功能损伤及骨骼软化[8]，Al在体内的蓄积可能具有引发软骨病、低血色素性贫血、老年性痴呆和慢性肾功能损伤等潜在风险[9]。现行2015年版《中国药典》（四部）通则“0102”对中药注射剂中部分元素按每日最大使用量进行逐一限量规定[10]。因此，对小牛血去蛋白提取物注射液中元素进行监测对保障用药安全具有重要意义。

电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）具有灵敏、准确、快速的优点，已成为同时测定多种痕量元素含量的首选方法[11-12]。本研究采用ICP-MS法同时测定了国内外3家企业24批小牛血去蛋白提取物注射液中Cd、Pb、As、Hg、钴（Co）、钒（V）、镍（Ni）、铊（Tl）、银（Ag）、钼（Mo）、铜（Cu）、铬（Cr）、钡（Ba）、Al等14种元素的含量，旨在为深入研究该药中各元素的分布及来源、临床用药的安全性评估及质量标准的提升提供依据，为类似的多组分生化药中多种元素的控制提供参考，为注射剂仿制药一致性评价中的元素控制提供支持。

1 材料

1.1 仪器

NexlON 300X型ICP-MS仪，包括雾化器、四级杆、检测器（美国Perkin Elmer公司）；WD-A型药物稳定性检查仪（天津药典标准仪器厂）；XS205型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Q型超纯水机（美国Millipore公司，电阻率：18.2 MΩ·cm）。

1.2 药品与试剂

小牛血去蛋白提取物注射液（进口A企业，批号：00911015、00921015、00931015、00941015、00951015、00961015、00971015、00991115、10923971、10924161、10924163、10946880、10946882、10958367、10960009，规格：10 mL∶400 mg，编号：S1～S15；国产 B 企业，批号：181013-2、181014-2、181015-2、1705003-2、1705004-2、1705005-1，规格：10 mL∶400 mg，编号：S16～S21；国产C企业，批号：10618023-2，规格：5 mL∶200 mg；批号：10718065-3、10718079-2，规格：10 mL∶400 mg；编号：S22～S24）；Hg标准品溶液（中国计量科学研究院，批号：GBW08617/18031，质量浓度：1 000 μg/mL）；Cd、Pb、As、Co、V、Ni、Tl、Ag、Mo、Cu、Cr、Ba、Al混合标准溶液（批号：3-122MKBY2，质量浓度均为10 μg/mL）以及铋（Bi）、锗（Ge）、铟（In）、铷（Lu）、铑（Rh）、钪（Sc）混合内标贮备液（批号：3-62MKBY2，质量浓度均为100 μg/mL）均购自美国Agilent公司；金（Au）标准品溶液（美国Inorganic Ventures公司，批号：K2-AU04064，质量浓度：1 000 μg/mL）；硝酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 ICP-MS条件

射频功率：1 350 W；载气（氩气）流量：1.1 L/min；碰撞气（氦气）流量：4.5 L/min；积分时间：1.5 s；等离子体气流量：18 L/min；采样深度：65 mm；进样蠕动泵转速：24.0 r/min；数据采样模式：跳峰模式；重复次数：3次。各元素分析参数见表1。

表1 各元素分析参数Tab 1 Analytical parameters of each element

2.2 溶液的制备

2.2.1 内标溶液 精密量取混合内标贮备液1 mL，置于100 mL聚四氟乙烯量瓶中，加1%硝酸溶液定容至刻度，摇匀，即得各内标元素质量浓度均为1 μg/mL的内标溶液。

2.2.2 混合标准品溶液 精密量取混合标准溶液0.5mL，置于10 mL聚四氟乙烯量瓶中，加1%硝酸溶液定容至刻度，摇匀，即得各元素质量浓度均为500 μg/L的混合标准品贮备液。精密量取Hg标准品溶液1 mL，置于20 mL聚四氟乙烯量瓶中，加1%硝酸溶液定容至刻度，摇匀，取1 mL，置于100 mL聚四氟乙烯量瓶中，加1%硝酸溶液定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为500 μg/L的Hg标准品贮备液。分别精密量取上述混合标准品贮备液及Hg标准品贮备液0.01、0.1、0.2、1、4、10、14 mL，置于100 mL聚四氟乙烯量瓶中，加入“2.2.1”项下内标溶液及Au稳定剂溶液（取Au标准品溶液适量，加1%硝酸溶液定容至刻度，制得质量浓度为1 μg/mL的Au稳定剂溶液）各1 mL，加1%硝酸溶液定容至刻度，摇匀，即得各元素质量浓度分别均为0.05、0.5、1、5、20、50、70 μg/L的系列混合标准品溶液。

2.2.3 供试品溶液 精密量取样品2 mL，置于100 mL聚四氟乙烯量瓶中，加入“2.2.1”项下内标溶液和“2.2.2”项下Au稳定剂溶液各1 mL，加1%硝酸溶液定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 空白溶液 以1%硝酸溶液为空白溶液。

2.3 线性关系考察

取“2.2.2”项下系列混合标准品溶液各适量，按“2.1”项下ICP-MS条件连续进样，记录仪器响应值。以各待测元素质量浓度（x，μg/L）为横坐标、各待测元素与内标的响应值比值（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表2。

表2 回归方程与线性范围Tab 2 Regression equation and linear range

2.4 定量限与检测限考察

取“2.2”项下空白溶液和系列混合标准品溶液各适量，按“2.1”项下ICP-MS条件连续进样测定10次，记录仪器响应值并计算标准偏差。以标准偏差与标准曲线斜率之比的10倍对应的元素质量浓度作为定量限，以标准偏差与标准曲线斜率之比的3倍对应的元素质量浓度作为检测限，结果见表3。

表3 定量限与检测限结果Tab 3 Quantitation limits and detection limits

2.5 精密度试验

精密量取“2.2.2”项下混合标准品溶液（质量浓度为20 μg/L）适量，按“2.1”项下ICP-MS条件连续进样测定6次，记录仪器响应值。结果，Cd、Pb、As、Hg、Co、V、Ni、Tl、Ag、Mo、Cu、Cr、Ba、Al仪器响应值的 RSD 分别为3.6%、4.2%、1.5%、3.7%、3.7%、2.2%、0.4%、1.6%、3.4%、0.9%、2.7%、2.1%、1.5%、0.8%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密量取“2.2.3”项下供试品溶液（编号：S24）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10 h时按“2.1”项下ICPMS条件进样测定，记录仪器响应值。结果，Cd、Pb、As、Hg、Co、V、Ni、Tl、Ag、Mo、Cu、Cr、Ba、Al仪器响应值的RSD分别为3.2%、4.0%、1.9%、7.8%、2.2%、3.0%、2.1%、1.9%、4.2%、2.0%、3.4%、2.5%、3.6%、3.8%（n＝6），表明供试品溶液于室温放置10 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

精密量取样品（编号：S24）1 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下ICP-MS条件进样测定，记录仪器响应值并按内标法计算样品中14种元素的含量。结果，Cd、Pb、As、Hg、Co、V、Ni、Tl、Ag、Mo、Cu、Cr、Ba、Al的平均含量分别为0.201 5、0.091 3、0.100 4、0.077 6、0.039 4、0.094 6、0.998 9、0.115 1、0.280 6、0.412 6、0.034 9、1.625 3、5.999 4、14.146 6 μg/L，仪器响应值的RSD分别为4.4%、6.4%、2.8%、5.4%、4.8%、3.8%、1.6%、3.9%、4.0%、1.0%、2.6%、2.2%、2.8%、1.5%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密量取已知含量的样品（编号：S24）2 mL，共9份，分别置于100 mL聚四氟乙烯量瓶中，加入低、中、高质量浓度的混合标准品溶液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下ICP-MS条件进样测定，记录仪器响应值并计算加样回收率，结果见表4。

表4 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 4 Results of recovery tests（n＝9）

续表4Continued tab 4

续表4Continued tab 4

2.9 样品含量测定

取24批样品适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下ICP-MS条件进样测定，记录仪器响应值并按内标法计算样品中各元素的含量，结果见表5（表中，“-”表示未检出，下同）。

2.10 每日最大暴露量（PDE）分析

国际人用药品注册技术协调会（ICH）发布的指导原则“Q3D”中将药品所含的元素（除Al外）按其风险由高到低分为1类（包括Cd、Pb、As、Hg）、2A类（包括Co、V、Ni、Tl）、2B 类（Ag）及 3类（包括 Mo、Cu、Cr、Ba），并对各元素按口服、注射、吸入等3种不同剂型分别规定了PDE[13]。按照该指导原则，根据公式：PDE＝样品中各元素的质量浓度×日服用剂量，将表5中（除Al外）各元素的含量结果进行换算，结果见表6。

由表6可知，24批样品中13种元素均未超过出ICH的限量值[13]。国产C企业的3批样品中Cd含量分别达到限量值的25%、40%、25%，Pb、As、Hg均未超过ICH限量值的15%，其他元素均未超过ICH限量值的20%。提示该药含有的元素含量水平虽然存在差异，但均低于ICH限量值，因此该药用于临床是安全的。

表5 样品含量测定结果（n＝3，μg/L）Tab 5 Results of content determination of samples（n＝3，μg/L）

2.11 Al含量分析

将24批样品（与已测定的样品同批号但未开封）分别于25、45 ℃放置60 d后，取适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下ICP-MS条件进样测定，记录仪器响应值并按内标法计算样品中Al的含量，结果见表7。

Al在ICH指导原则Q3D中被认定为“可能导致损伤的其他元素杂质”[13]，但未给出限量值，其限量值可遵从其他指导原则和/或地方法规和规范，如现行《美国药典》（41版）规定了全肠外营养治疗用大容量注射液中Al含量限量为 25 μg/L[14]；《欧洲药典》（9.0版）和 2015 年版《中国药典》（三部）均规定人血白蛋白注射液中Al含量限量为200 μg/L[10，15]。因此，小牛血去蛋白提取物注射液说明书参照上述文献的规定，设定Al含量限量为200 μg/L。

由表7可知，3家企业各批样品中Al含量在放置60 d后均有所升高。25℃条件下，A、B、C企业样品中Al含量分别平均升高了14.8%、2.5%、67.9%；45℃条件下，分别平均升高了51.5%、19.1%、165.8%，放置前Al含量较高的在放置后升高程度越明显。国产B企业样品在放置前Al含量最低，45℃放置60 d后，Al含量的最高值为113.513 μg/L（编号：S20），仍未超过200 μg/L的限量值；所有企业中，仅国产B企业6批样品中的Al含量符合上述限量要求。

表6 13种元素的PDE（μg/d）Tab 6 Permitted daily exposure of 13 elements（μg/d）

表7 不同温度条件下放置60 d后Al含量比较（n＝3）Tab 7 Comparison of aluminium content after 60 days storage at different temperatures（n＝3）

3 讨论

3.1 样品前处理方式的选择

前期预试验发现，采用微波消解样品后，虽然可以使样品中的肽类成分得到有效破坏，但消解过程中使用的硝酸会引入一定量的待测元素，而造成空白值明显升高，加之浓酸的挥发以及溶液转移过程可能会造成样品中待测元素损失，进而使样品测定结果的准确度降低，因此微波消解法并不适用。另外，由于样品中添加的辅料为2.68%氯化钠，这超出了ICP-MS仪器测定样品时的溶液含盐量限量（不超过0.05%），因此直接测定法不适用。综合考虑，笔者分别尝试将样品经1%硝酸溶液稀释10倍、20倍、50倍和100倍后进样测定。结果显示，当样品稀释10倍或20倍时，部分元素的加样回收率接近150%，且内标元素的响应值与标准品溶液测定时比较明显降低，提示基质干扰较严重；当样品稀释100倍时，由于稀释度过大，使得样品中部分元素的测定结果低于定量限，而影响测定的准确性。因此，选择将样品稀释50倍后测定，经方法学验证均符合2015年版《中国药典》（四部）的相关要求[10]。

3.2 测量模式的选择

前期预试验中，笔者采用标准模式和动能歧视模式对各待测元素进行方法学验证。结果显示，采用动能歧视模式测定时，As、V、Cr等3种元素的检测限均低于标准模式一个数量级以上，其他元素采用两种模式测定时则无明显差异。考虑到碰撞气（氦气）价格较为昂贵，以及为提高检测结果的准确度，最终选择动能歧视模式测定As、V、Cr，采用标准模式测定其他11种元素。

3.3 Al含量结果分析

本研究结果显示，国产B企业的6批样品中Al含量（编号：S16～S21）符合规定（Al含量限量为200 μg/L），进口A企业和国产C企业的样品均超出限量值，特别是国产C企业的3批样品（编号：S22～S24）中Al含量均高达限量值的3～4倍。其原因可能为各企业使用的玻璃容器质量不同，在放置过程中，玻瓶容器中的金属离子向药品发生了迁移。不同企业生产的样品中Al含量差异较大，部分企业的样品中Al含量超过限量值问题应引起重视，特别是静脉注射剂中过量的Al长期直接注入血液，可引起骨软化、阿尔茨海默病、低色素性贫血、慢性肾功能损伤等潜在风险[16]，因此在现行质量标准中增加对Al含量进行监控就显得十分必要。此外，3家企业样品的保质期各有不同，国产B企业为18个月，C企业为24个月，进口A企业为60个月。由于玻瓶容器中Al可随贮藏时间的延长而不断浸出，因此建议重新设定该样品的有效期，以保障用药的安全性。

综上所述，该方法操作简便、准确，精密度、稳定性、重复性均较好，可用于同时测定小牛血去蛋白提取物注射液中14种元素的含量。