赵 玲 柯亭羽 郭 佳 李孔龙 潘 毅 王 曦

糖尿病肾病是2型糖尿病的主要慢性并发症之一，其降低了患者的生活质量,增加了糖尿病病死率，给卫生保健系统造成了沉重的负担。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)患者出现肾功能不全后，其肾功能恶化的进展速度较一般肾小球肾炎快，接受肾脏替代治疗时的预后也比一般慢性肾脏疾病差[1]。所以DN的早期诊断、治疗及高危人群的筛查显得尤为重要。高血糖是DN发生、发展的重要因素，但却不是唯一因素。DN的发生、发展还与复杂的遗传背景相关，这可能部分归因于遗传易感性[2]。本研究就SLCO1B1基因多态性及脂代谢在2型糖尿病肾病发病中的作用进行研究。

对象与方法

1.对象:(1)对照组：选取2016年于昆明医科大学第二附属医院心内科因高血压或者冠心病住院的患者共66例，均无内分泌疾病及糖尿病家族史。(2)2型糖尿病非肾病及肾病组：选取2016年于昆明医科大学第二附属医院住院的2型糖尿病患者100例，按尿白蛋白/肌酐比值(albumin /creatinine ratio，ACR)再分为2型糖尿病未合并肾病组即DN(-)组，共60例；2型糖尿病肾病组即DN(+)组，共40例。

2.诊断标准:(1)糖尿病的诊断标准:采用1999年WHO提出的糖尿病诊断标准：①糖尿病症状(典型的糖尿病症状包括多尿、多饮和无法解释的体重降低)，任意时间血浆葡萄糖≥11.1mmol/L(200mg/dl)；②空腹(空腹是指无热量摄入至少8h)血浆葡萄糖≥7.0mmol/L(126mg/dl)；③口服葡萄糖耐量实验，葡萄糖(75g无水葡萄糖)负荷后2h血糖≥11.1mmol/L(200mg/dl)。(2)糖尿病肾病诊断标准:2014 年美国糖尿病协会(American Diabetes Association，ADA)与美国肾脏病基金会(National Kidney Foundation，NKF)达成共识，认为 DKD(diabetic kidney disease)是指由糖尿病引起的慢性肾病，主要包括肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)低于60ml/(min·1.73m2)或尿白蛋白/肌酐比值(ACR)>30mg/g持续超过3个月。 本研究将ACR>30mg/g定义为糖尿病肾病。

3.排除标准:(1)1型糖尿病患者。(2)严重的心脏、肝、肾衰竭患者。(3)药物中毒，感染和多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、尿路感染、输尿管结石和肿瘤、肾脏疾病等可能引起蛋白尿的疾病。(4)24h内有剧烈运动者。(5)有放射线接触史者。(6)孕妇或者哺乳期者。(7)各受试对象间有血缘关系。

4.标本和临床资料的采集:(1)姓名、性别、年龄、身高(cm)、体重(kg)、计算体重指数(BMI=体重/身高2，kg/m2)、糖尿病病程、用药史。(2)所有研究对象空腹8h后清晨采集静脉血4ml用于测定甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、肝功能、肾功能指标。(3)采集晨尿测定尿液分析+尿沉渣定量、尿微量白蛋白。(4)尿蛋白定性及尿微量白蛋白异常的患者还收集24h尿蛋白定量结果。(5)采集2ml静脉血加入EDTA抗凝剂，用于DNA的提取、PCR扩增，进行ApoE、SLCO1B1基因多态性分析。

5.检测方法及原理:多重荧光定量PCR技术，基于荧光定量PCR平台，首先针对SNP位点上下游设计特异性引物，分别针对野生型及突变型位点设计不同荧光基团标记的特异性探针，然后对引物及探针进行科学的配比组合，配置SNP位点检测体系，通过荧光定量PCR仪对临床样本DNA进行PCR扩增，同时收集扩增信号，如果信号为野生型探针信号，那么样本为纯合野生型；如果信号为突变型探针信号，那么样本为纯合突变型；如果信号同时有野生型及突变型探针信号，那么样本为杂合突变型。

结 果

1.3组间血脂的比较:3组人群的甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇经单因素方差分析，发现高密度脂蛋白胆固醇比较，差异有统计学意义(P<0.05)，进而采用LSD法进行两两比较发现，对照组和DN(+)组(P=0.040)、DN(-)组和DN(+)组(P=0.013)高密度脂蛋白胆固醇比较，差异有统计学意义。DN(-)组和DN(+)组血脂比较，两组患者的甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋胆固醇白经两独立样本t检验，发现DN(+)组高密度脂蛋白胆固醇水平低于DN(-)组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

2.SLCO1B1基因多态性与2型糖尿病肾病:3组人群SLCO1B1基因型频率比较:(1)3组人群388A>G、521T>G位点基因型分布情况,详见表2、图1。(2)SLCO1B1基因388A>G(χ2=1.709，P=0.750)和521T>G(χ2=1.786，P=0.755)的基因型频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 3组人群血脂比较

3组人群SLCO1B1 388A>G、521T>G位点等位基因频率比较:(1)3组人群388A>G、521T>G位点等位基因分布情况,详见表3、图2。(2)3组患者组SLCO1B1等位基因频率经χ2检验，388A>G(χ2=1.279，P=0.528)和521T>G(χ2=0.103，P=0.950)等位基因比较，差异无统计学意义。

3组人群SLCO1B1基因单倍型分析:(1)3组人群SLCO1B1基因单倍型分布详见表4、图3。(2)3组人群SLCO1B1基因单倍型频率经χ2检验差异无统计学意义(χ2=1.237，P=0.872)。

表2 3组SLCO1B 1 基因型频率比较 [n(%)]

图1 SLCO1B1 388A>G、521T>C位点基因型频率分布

表3 3组间SLCO1B 1388A>G、521T>G位点等位基因频率比较[n(%)]

组别388A>G521T>GAGCT对照组34(25.76)98(74.24)15(11.36)117(88.64)DN(-)组32(26.67)88(73.33)15(12.50)105(87.50)DN(+)组16(20.00)64(80.00)9(11.25)71(88.75)合计82(24.70)250(75.30)39(11.75)293(88.25)

图2 SLCO1B1 388A>G、521T>C等位基因频率分布

表4 SLCO1B1基因单倍型频率比较

组别*15*1a*1b合计对照组5(7.58)3(4.55)58(87.88)66DN(-)组4(6.67)4(6.67)52(86.67)60DN(+)组4(10.00)1(2.50)35(87.50)40合计13(7.83)8(4.82)145(87.35)166

图3 SLCO1B1单倍体型频率分布

讨 论

OATP1B1基因是主要的肝脏转入载体，在人体肝脏基底膜外侧表达。其生理功能包括：介导肝细胞膜转运内、外源性物质并对其进行代谢和消除。人类OATP1B1基因位于12号染色体的短臂21区2带，全长108.59kb，包括15个外显子和14个内含子，其编码基因SLCO1B1的cDNA包含2073个碱基，编码697个氨基酸，具有高度遗传多态性。其中，被研究最多也是在亚洲人群中最常见的2个非同义突变为388A>G和521T>C，在中国人群中388A>G和521T>C的突变率分别为73.4%和14%。SLCO1B1基因(A388G)和(T521C)两位点的非同义突变可随机组合为3种单倍体类型：双野生型(两位点均没有突变*1A(388A521T)、双突变型(两个位点均突变)*15(388G521C)和单突变型(只有1个位点突变)*1B(388G521T)或*5(388A521C)[3，4]。常见的521T>C位于蛋白跨膜区，可使 OATP1B1的与底物的亲和力下降，转运活性下降[5]。具有521T> C变异的单倍体，如SLCO1B1*5、*15～*17等，有相似的表型，所编码的蛋白转运功能下降。体内试验已经发现携带521C等位基因的个体OATP1B1转运活性下降，可减少多种药物进入肝细胞的速率，阻碍药物代谢[6]。388A>G，不仅构成SLCO1B1*1b，还存在于 SLCO1B1*15中(388G-521C)。SLCO1B1* 1b对转运功能的影响还没有一致的结论，部分研究认为它对蛋白的功能没有影响，但一些研究认为会增强转运作用。

目前，对SLCO1B1基因的研究主要集中于SLCO1B1基因多态性对药物代谢、治疗效果及相关不良反应方面的研究，其中以研究他汀类降脂药及口服降糖药疗效的研究居多。而目前SLCO1BI与疾病相关性的研究甚少，有研究显示SLCO1B1基因 388A>G和521T>C基因多态性与云南白族人群冠心病发病之间可能无相关性[7]。另一项研究同样也显示SLCO1B1 388A>G和521T>C的基因型和等位基因频率以及SLCO1B1基因单倍体频率在冠心病组和对照组比较，差异无统计学意义[8]。本研究显示SLCO1B1 388A>G和521T>C的基因型和等位基因频率以及SLCO1B1基因单倍体频率在DN(-)、DN(+)组和对照组比较，差异无统计学意义，研究认为SLCO1B1 388A>G和521T>C位点基因多态性与2型糖尿病、2型糖尿病肾病无明显的相关性。

糖尿病肾病的主要病理变化是肾脏高灌注、高滤过、肾小球基膜增厚以及肾小球系膜区为主的细胞外基质积累，导致弥漫性或结节性肾小球硬化。目前研究发现肾小球硬化与动脉粥样硬化有相似的病理生理过程，均与血脂异常有关[9]。大量研究显示2型糖尿病患者血脂紊乱和DN之间有着高度的相关性。研究发现合并高TG血症及高LDL-C血症的早期DN患者的尿微量白蛋白明显高于未合并以上血脂紊乱者[10]。有研究显示，糖尿病肾病各组与无肾病组比较，HDL-C明显降低，随着肾脏损害的加重，血脂紊乱加剧，表现为TG、TC、LDL-C、Apro-B逐步升高，而HDL-C、Apro-A逐渐降低[11]。本研究得到了与上述研究类似的结果，与DN(-)组比较，DN(+)组的高密度脂蛋白胆固醇明显降低，Logistic回归分析显示，HDL-C降低是2型糖尿病肾病发病的危险因素。脂代谢紊乱导致糖尿病肾病的主要机制可能有以下几种：(1)LDL-C与肾小球内膜下基质结合，发生氧化修饰与被巨噬细胞吞噬，引起泡沫细胞的形成，导致脂质沉积，与动脉硬化相似，肾小球硬化与巨噬细胞转化为泡沫细胞有密切的联系[12]。(2)HDL-C具有抗动脉粥样硬化的作用。它能促进胆固醇的排泄，加速极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)的代谢，防止动脉壁脂质的沉积，因此是防止动脉粥样硬化的保护因子。当HDL-C降低时，可能促进肾动脉粥样硬化的发生，导致糖尿病肾病。(3)纤溶酶活性可被脂蛋白竞争性抑制，通过肾小球毛细血管凝血和血栓形成，改变肾小球血流动力学，从而使缺氧、缺血加重[13]。(4)氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox LDL)有细胞毒性、促炎症和免疫特性，可通过细胞毒性诱导细胞凋亡[14]。

近年来，研究者相继发现了一些与糖尿病肾病有关的遗传易感基因和易感染色体位点，这不仅有助于在分子水平认识糖尿病肾病的发病机制，同时还可能鉴定出高危人群，以利于早期诊断及防治、个体化药物治疗甚至进行基因治疗[15]。因此，从遗传学角度阐述2型糖尿病肾病对疾病的预诊断以及临床治疗意义重大。