朱晓文， 孙传涛， 李胜保， 许为佳

湖北省十堰市太和医院 1.消化内科； 2.肾内科，湖北 十堰 442000

近年来，随着生活水平的不断提升及人口的老龄化，食管腺癌的发病率呈逐年上升的趋势[1]，有文献报道，Barrett食管被认为是食管腺癌发生、发展过程中的关键步骤，预防或靶向干预Barrett食管病变可预防食管腺癌的形成[2]。目前缺乏从“食管上皮黏膜-Barrett食管-食管腺癌”诊断和治疗的有效靶点。目前基因组学的发展为肿瘤的治疗提供了新的思路，肿瘤相关抑癌基因丢失是肿瘤形成的重要因素[3]。PAX-5作为新发现的抑癌基因，其异常表达与多种实体肿瘤密切相关，如：乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌中异常表达[4-6]，但其在食管腺癌中的致病机制尚未见报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取十堰市太和医院2015年8月至2017年8月就诊的胃食管反流病患者的病理资料。纳入标准：(1)所有诊断Barrett食管的患者符合中华医学会消化病学分会制订的《Barrett食管诊治共识(2011修订版)》的诊断标准[7]；(2)正常食管上皮和食管腺癌的病理诊断由本院2位高年资病理科医师诊断。排除标准：临床资料不全者、合并严重糖尿病和(或)心脏病疾病、转移性肿瘤、既往胃肠道手术治疗史。

1.2 主要试剂蛋白提取试剂盒购自北京普利莱科技公司(批号：180778)，PAX-5单克隆抗体购自美国Abcam公司(批号：ab109443)，二抗GAPDH购自上海碧云天科技公司(批号：3123455)，PAX-5引物由上海生工生物工程股份有限公司合成及提供(批号：1822834)，RNA提取试剂盒购自美国应用生物系统公司，逆转录试剂盒购自美国Promega公司(批号:4512386)。消化内镜购自奥林巴斯公司，蛋白凝胶系统成像仪购自美国Lightools公司，实时荧光定量PCR仪购自美国应用生物系统公司。SEG1和OE33是食管腺癌细胞系，CP-C和CP-D是Barrett食管细胞系，Het-1A是正常食管上皮细胞系，所有细胞系均来源于ATCC细胞库。

1.3 组织RNA和蛋白提取所有细胞系、组织RNA和蛋白提取按照试剂盒说明书操作[8]。提取的RNA和蛋白测浓度后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.4 细胞转染PAX-5过表达载体购自广州辉骏生物科技有限公司。质粒转染方法和步骤同文献[8-9]，活性状态下的食管腺癌细胞OE33种于6孔板中，离心半径13.5 cm，1 800 r/min离心5 min，消化离心并重新种板，当细胞融合度为80%～90%时进行细胞转染。转染载体：Lipofectamine 2000(美国通用应力公司)，细胞转染48 h后收集实验组和对照组细胞进行相应的功能实验。

1.5 Transwell实验迁移实验：收集上述过表达PAX-5和对照pcDNA3.1(+)的食管腺癌细胞OE33，离心半径13.5 cm，1 800 r/min离心5 min，消化离心，倒置显微镜下计数，并分别取实验组和对照组细胞(4×103个)，种于Transwell小室上室，下室加入质量浓度为150 g/L胎牛血清1640约700 μl，置于细胞孵育箱中继续培养，待20 h后取出小室，固定、染色、计数(显微镜下随机5个视野)，计数并评价细胞迁移能力。侵袭实验：在Transwell小室上室中加入基质胶(无血清1640∶基质胶=1∶7)混匀后加入，将加入基质胶的小室放入细胞孵育箱中2～4 h，待基质胶凝固后进行侵袭实验，侵袭实验步骤基本同细胞迁移实验。

1.6 qRT-PCR核酸检测仪进行总RNA定量检测，所取的细胞和组织的OD260/OD280比值为1.8～2.2。按照5×PrimeScriptRTMaster Mix试剂盒说明书逆转录为cDNA，以及Promega试剂盒中说明书进行扩增。qRT-PCR上机总反应体系如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；25 ℃ 10 min。其中内参循环23个，目的循环32个。引物序列：PAX-5-F：5′-CACTCTCAGTGAGATGTTCC-3′，PAX-5-R：5′-TGCTCTCATTATGATAGCTG-3′；E-cad-F：5′-TACAC

TGCCCAGGAGCCAGA-3′，E-cad-R：5′-TGGCACCAGTGTCCGGATTA-3′；Vim-F：5′-GACCAGCTAACCAACGACAA-3′，Vim-R：5′-GTCAACATCCTGTCTGAAAGAT-3′；N-cad-F：5′-CGAATGGATGAAAGACCCATCC-3′，N-cad-R：5′-GGAGCCACTGCCTTCATAGTCA-3′；Occ-F：5′-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3′，Occ-R：5′-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3′。

1.7 免疫蛋白印迹实验提取上述组织蛋白质，采用BCA法测定蛋白浓度。配制分离胶和浓缩胶，分别取45 μg/孔进行凝胶电泳，转膜，质量浓度为50 g/L脱脂牛奶的TBST封闭1 h后，加入PAX-5一抗以及内参GAPDH，4 ℃冰箱过夜。第2天常温下复温，TBST液洗膜二抗封闭液稀释室温下孵育2 h，显色剂显色、成像仪曝光，并用Quantity One软件分析蛋白灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH比值表示相对表达差异。

1.8 统计学分析采用SPSS 17.0统计学软件进行分析。各实验独立重复3次，两独立样本数据间的比较采用双侧t检验；多组数据的比较采用方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PAX-5在食管腺癌细胞和组织中表达首先通过qRT-PCR验证PAX-5在人正常食管上皮细胞、Barrett食管细胞、食管腺癌细胞中的相对表达；结果显示：与正常食管上皮细胞Het-1A相比，PAX-5 mRNA在SEG1、OE33、CP-C和CP-D中表达下调，在食管腺癌细胞系OE33中表达最低(见图1A，P<0.001)；因此本实验采用OE33为研究对象，进行细胞功能实验。进一步分析人正常食管组织、Barrett食管组织、食管腺癌组织中的相对表达，我们发现：与人正常食管组织相比，PAX-5 mRNA在Barrett食管组织、食管腺癌组织中表达下调，且在食管腺癌组织中表达水平最低(P<0.001，见图1B)。因此，我们推测PAX-5在食管腺癌中表达下调，可能作为潜在的抑癌基因参与“食管上皮黏膜-Barrett食管-食管腺癌”这一病理生理过程。

注:与Het-1A比较，*P<0.001。图1 PAX-5 mRNA在人食管细胞和组织表达情况 A：qRT-PCR中PAX-5 mRNA在Barrett食管和食管腺癌细胞系中表达下调；B：qRT-PCR中PAX-5 mRNA在Barrett食管组织、食管腺癌组织中表达下调Fig 1 Expression of PAX-5 mRNA in esophagus cells and tissues A: the expression of PAX-5 mRNA in Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma cell lines was down-regulated by qRT-PCR; B: the expression of PAX-5 mRNA in Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma tissue was down-regulated by qRT-PCR

2.2 PAX-5蛋白在食管腺癌中表达免疫蛋白印迹实验进一步验证PAX-5蛋白在人正常食管组织、Barrett食管组织、食管腺癌组织中的相对表达，结果显示(见图2A)：与人正常食管组织相比，PAX-5蛋白在Barrett食管组织、食管腺癌组织中表达下调，在食管腺癌组织中表达水平最低，Quantity One软件分析蛋白灰度值分析发现，其表达差异有统计学意义(P<0.001)。免疫蛋白印迹实验在配对的Barrett食管和食管腺癌中进行了验证(见图2B～2C)，发现配对组织中与人正常食管黏膜上皮相比，PAX-5蛋白在Barrett食管、食管腺癌中表达下调，Quantity One软件分析蛋白灰度值分析发现，其表达差异有统计学意义(P<0.001)。

注:与正常食管比较，*P<0.001。图2 PAX-5蛋白在人食管组织表达情况 A：Western blotting中PAX-5蛋白在Barrett食管、食管腺癌中表达下调；B：在配对Barrett食管中，PAX-5蛋白表达下调；C：在配对食管腺癌中，PAX-5蛋白表达下调 Fig 2 Expression of PAX-5 protein in esophagus tissues A: the expression of PAX-5 proteins in Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma was down-regulated by Western blotting; B: in paired Barrett’s esophagus, the expression of PAX-5 proteins was down-regulated; C: in paired esophageal adenocarcinoma, the expression of PAX-5 proteins was down-regulated

2.3 PAX-5 mRNA在食管腺癌中的表达及与临床病理参数的关系PAX-5在食管腺癌组织中的表达水平与患者年龄、性别、复发及血管侵犯均无关(P>0.05)，而与肿瘤T分期(P=0.015)和局部淋巴结转移情况(P=0.0029)呈正相关，与肿瘤分化程度呈负相关(P=0.0021)，即肿瘤分化程度越低，PAX-5表达水平越高(见表1)。

2.4 PAX-5抑制食管腺癌细胞OE33迁移和侵袭通过Transwell实验检测PAX-5对细胞迁移和侵袭的影响，结果显示：对照组PAX-5中迁移细胞数为(231±33)个，实验组PAX-5中迁移细胞数为(427±41)个；对照组PAX-5中侵袭细胞数为(212±29)个，实验组PAX-5中侵袭细胞数为(118±24)个。过表达PAX-5组的OE33细胞迁移和侵袭到小室底部的细胞明显减少(P<0.001，见图3)。

2.5 PAX-5抑制食管腺癌细胞OE33的上皮-间质转化分别取实验组和对照组中细胞，提取总RNA和总蛋白，采用qRT-PCR法和免疫蛋白质印迹检测上皮-间质转化相关分子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Occuludin的表达水平。结果显示，PAX-5过表达后，Vimentin、N-cadherin的蛋白和mRNA表达水平降低，E-cadherin、Occuludin的蛋白和mRNA表达水平升高(见图4，P<0.001)。

表1 PAX-5的表达与临床病理特征的关系Tab 1 Correlation between PAX-5 expression and clinicopa-thological features of esophageal adenocarcinoma

3 讨论

食管腺癌的发生通常是“食管上皮黏膜-Barrett食管-食管腺癌”的病理性变化过程，其发生、发展由众多基因异常调控，既往文献[10]报道显示，食管慢性炎症、长期胃食管反流氧化应激损伤导致p53、p16等基因异常缺失。基因组结构变化导致非整倍性染色体发生，通常见于重度异型增生；异型细胞多克隆无限扩增直至肿瘤形成。目前食管癌的发病人群高，多数患者确诊时已是Ⅲ期和Ⅳ期患者，因此食管癌的死亡人数和死亡率高；发现具有诊断性意义的靶基因具有重要的临床意义[9]。

PAX-5主要表达B细胞相关的核转录因子，在早期B细胞分化发育过程中具有重要的调控作用。文献报道，PAX-5α编码B细胞特异激活蛋白(B cell lineage specific activator protein，BSAP)，仅在B细胞系特异性表达；PAX-5β在B细胞、睾丸、中枢神经系统中转录表达[11]；研究发现，PAX-5α和PAX-5β基因启动子区频发甲基化[12]。PAX-5能通过结构域结合调控160种以上的下游基因，在B细胞的发育过程中涉及B细胞的免疫功能、受体信号传导、转录调控及迁延黏附等[13]。研究显示，在人类某些肿瘤中，如：胃癌、肝癌、乳腺癌、非小细胞肺癌中，PAX-5表达缺失，通过进一步研究发现，PAX-5起着抑制肿瘤生成的作用[4-5，12-13]。MŽIK等[14]发现，PAX-5在正常人肝脏组织中正常表达，而肝癌细胞株中表达沉默或缺失83%(10/12)；PAX-5在原发性肝细胞癌表达水平显著低于邻近的正常组织，PAX-5的表达缺失与启动子甲基化密切相关；恢复沉默肝癌细胞株抑制细胞的PAX-5表达，在体外能诱导细胞的凋亡，并抑制裸鼠移植瘤的生长。同时也有文献报道，PAX-5是细胞增殖、凋亡、表型转变的分子标志物；在细胞凋亡中起着某些特定的作用[12-14]。PALMISANO等[15]报道，PAX-5α和PAX-5β存在2个不同的CpG位点，由2个不同的启动子转录形成，在细胞分化和胚胎发育中编码着起重要作用的不同转录因子；酸性亚硫酸盐测序发现，每个CpG位点高甲基化与转录沉默密切相关。同时通过甲基化检测发现，在乳腺和肺癌中甲基化率高达65%，PAX-5β基因在乳腺癌和肺癌中的表达沉默与CD19基因表达缺失密切相关。因此，PAX-5可能作为一个候选抑癌基因参与了部分实体肿瘤的发生、发展。

图4 过表达PAX-5对食管腺癌上皮-间质转化相关蛋白的影响 Fig 4 Effects of overexpression of PAX-5 on related proteins of epithelial mesenchymal transformation in esopheal adenocarcinoma

目前PAX-5在食管腺癌的病理生理过程尚未见报道，本实验通过qRT-PCR和免疫蛋白印迹实验发现：与正常食管黏膜相比，PAX-5 mRNA和蛋白在Barrett食管和食管腺癌中表达下调，差异有统计学意义；同时在配对的Barrett食管和食管腺癌组织中，通过qRT-PCR和免疫蛋白印迹实验发现：与正常食管黏膜相比，PAX-5 mRNA和蛋白在配对组织中表达下调，差异有统计学意义。因此，我们推测PAX-5在Barrett食管和食管腺癌中表达下调，可能作为潜在的抑癌基因参与“食管上皮黏膜-Barrett食管-食管腺癌”这一病理性进展过程，可能是食管腺癌早期诊断的靶基因。通过对PAX-5在食管腺癌的临床病理分期研究发现，其表达与肿瘤T分期和局部淋巴结转移情况呈正相关，与肿瘤分化程度呈负相关，即肿瘤分化程度越低，PAX-5表达水平越高，提示预后不良；与肿瘤的远处转移有密切的关系。而上皮-间质转化是一种进化上保守的发育程序，与肿瘤的转移密切相关，通过增强细胞的迁移、侵袭和抗凋亡刺激来赋予癌细胞的转移特性。在癌细胞中，上皮-间质转化由来自肿瘤微环境的细胞外刺激异常调节，包括生长因子和炎性细胞因子，以及瘤内物理应激，如低氧。进一步通过Transwell实验发现，PAX-5基因在实验组细胞中的迁移和侵袭能力明显下调，提示PAX-5基因可能作为功能性抑癌基因参与到食管腺癌的病理性进程[9]。为进一步明确PAX-5抑制食管腺癌细胞OE33迁移和侵袭的分子机制，通过免疫蛋白印迹实验和qRT-PCR实验发现，恢复表达PAX-5基因后，Vimentin、N-cadherin的蛋白和mRNA表达水平降低，E-cadherin、Occuludin蛋白和mRNA表达水平升高，和文献报道相一致。

综上所述，PAX-5基因在食管腺癌中表达下调，可能作为功能性抑癌基因参与“食管上皮黏膜-Barrett食管-食管腺癌”的病理性变化过程。