韩伟佳， 吴 桥， 丁 美， 张晓慧， 刘 霜， 陈 煜， 段钟平

首都医科大学附属北京佑安医院疑难肝病及人工肝中心 肝衰竭与人工肝治疗研究 北京市重点实验室，北京100069

药物性肝损伤(drug-induced liver injury, DILI)是指因服用常规剂量或过量剂量药物，导致药物本身或其代谢产物引起的直接肝损伤，或是人体对药物和/或代谢成分产生过敏或特异质反应而导致的肝损伤，常引起生化指标的异常，严重者甚至最终进展成肝硬化和肝坏死[1]。使用肝毒性的药物治疗期间需密切监测肝功生化指标，必要时需停药并加用保肝药物，是预防DILI的重要策略之一[2]。

在保肝药物选择方面，中医药是对传统中药汤剂的继承和创新，在疾病治疗过程中发挥了重要作用。肝爽颗粒是保定步长制药有限公司生产的中成药新药，主要功能为舒肝健脾、清热散瘀、保肝护肝、软坚散结，用于急慢性肝炎、肝硬化、肝功能损伤[3-4]。有研究[5]发现，在肝爽颗粒中，主要发挥作用的成分为柚皮苷。

在分子生物学方面，DILI的发生常与细胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)的功能密切相关[6]。有研究发现，柚皮苷可以降低CYP450酶的活性[7-8]。据此，我们推测肝爽颗粒主要成分柚皮苷可通过抑制CYP450家族基因的表达预防DILI的发生。药物通过转运蛋白进入细胞，通过第一阶段代谢酶进行氧化反应，再通过第二阶段代谢酶进行结合反应。药物经过每一个阶段的代谢酶作用所产生的代谢产物都具有肝毒性，主要表现为激活活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)、免疫反应、炎症反应、线粒体和细胞核损伤，进而导致细胞凋亡。在第一阶段，CYP450是最主要的代谢酶。所以，降低CYP450酶的表达是减轻药物损伤的一个重要方式(见图1)。为此，本研究在7702细胞中观察肝爽颗粒的主要成分柚皮苷是否对已知的公认的具有肝毒性的药物曲格列酮[9]和双氯芬酸钠[10]具有对抗作用，如果有，机制是否为降低CYP450系列酶的活性，期待为预防DILI提供新的思路。

图1 DILI的机制 Fig 1 The mechanism of DILI

1 材料与方法

1.1 实验细胞来源正常人肝细胞株HL-7702细胞保存于北京市肝衰竭与人工肝治疗研究重点实验室。

1.2 药品制备将曲格列酮溶解于0.1%的二甲亚矾(DMSO)中配置成100 mmol/L浓度原液，保存于-4 ℃中；将双氯芬酸钠溶解于0.1%的DMSO中配置成400 mmol/L浓度原液，保存于-4 ℃中；将柚皮苷配置成20 mmol/L浓度原液，保存于-4 ℃中。

1.3 主要试剂和仪器Cell Counting Kit-8(CCK8)购自DojinDo东仁化学科技(上海)有限公司；SYBRTMPremix Ex TaqTM、SuperScript Ⅲ Platinum Twostep 实时定量PCR(qRT-PCR)试剂盒和总RNA提取试剂Trizol均购自美国Invitrogen公司；曲格列酮、双氯芬酸钠均购自美国MCE公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、双抗(含青霉素、链霉素)购自美国Gibco公司。主要仪器：酶标仪购自美国Sigma公司；96孔板、24孔板购自德国Corning公司；Applied BiosystemsTMPCR热循环仪购自Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 细胞培养HL-7702细胞于质量浓度为100 g/L FBS、10 g/L双抗的RPMI 1640培养液中常规培养传代。待细胞生长至80%融合时，以质量浓度为2.5 g/L EDTA-胰蛋白酶消化传代。(1)取对数生长期细胞接种于96孔板中进行细胞毒性实验。细胞分组：正常对照组、不同浓度曲格列酮组、1 μmol/L柚皮苷+不同浓度曲格列酮组、10 μmol/L柚皮苷+不同浓度曲格列酮组、100 μmol/L柚皮苷+不同浓度曲格列酮组；正常对照组、不同浓度双氯芬酸钠组、1 μmol/L柚皮苷+不同浓度双氯芬酸钠组、10 μmol/L柚皮苷+不同浓度双氯芬酸钠组、100 μmol/L柚皮苷+不同浓度双氯芬酸钠组。(2)接种于24孔板进行qRT-PCR检测。细胞分组：正常对照组、1 μmol/L柚皮苷组、10 μmol/L柚皮苷组、100 μmol/L柚皮苷组。(3)接种于24孔板进行qRT-PCR检测。细胞分组a：正常对照组、100 μmol/L曲格列酮组、1 μmol/L柚皮苷+100 μmol/L曲格列酮组、10 μmol/L柚皮苷+100 μmol/L曲格列酮组、100 μmol/L柚皮苷+100 μmol/L曲格列酮组；细胞分组b：正常对照组、500 μmol/L双氯芬酸钠组、1 μmol/L柚皮苷+500 μmol/L双氯芬酸钠组、10 μmol/L柚皮苷+500 μmol/L双氯芬酸钠组、100 μmol/L柚皮苷+500 μmol/L双氯芬酸钠组。

1.5 标本收集及检测收集96孔板上清用于乳酸脱氢酶(LDH)水平检测。分别用Trizol刮取培养板底部细胞放入1.5 ml EP管中，-80 ℃冻存，以备之后的qRT-PCR检测。将上清培养基放入1.5 ml EP管中，-20 ℃储存，以备血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)送检。

1.6 CCK8检测弃各个分组的96孔板的上清，加入质量浓度为100 g/L CCK8的培养基100 μl，孵育30 min后，酶标仪中检测吸光度值，波长为450 nm。

1.7 qRT-PCR检测Trizol试剂提取HL-7702细胞总RNA，逆转录成互补cDNA，以此为模板，采用逆转录PCR扩增片段，按SYBR Premis EX Taq Ⅱ试剂盒说明书加样，用iQ5多重实时荧光定量PCR仪检测。所检测引物见表1，反应条件: 50 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 0.15 s，60 ℃ 0.3 s， 44个循环；55 ℃ 4 s，41个循环(见表1)。

2 结果

2.1 柚皮苷减轻药物肝细胞毒性的作用加入柚皮苷后，药物所致细胞毒性得到明显改善，100 μmol/L柚皮苷+曲格列酮组的IC50较曲格列酮组明显升高(351 μmol/Lvs126 μmol/L)，而1 μmol/L柚皮苷(IC50=197 μmol/L)和10 μmol/L柚皮苷(IC50=164 μmol/L)对曲格列酮所致DILI改善不明显。同样，100 μmol/L柚皮苷+双氯芬酸钠组的IC50较双氯芬酸钠组明显升高(39 883 μmol/Lvs724 μmol/L)，而1 μmol/L柚皮苷(IC50=1 563 μmol/L)和10 μmol/L柚皮苷(IC50=719 μmol/L)对双氯芬酸钠所致DILI改变不明显。LDH方面，100 μmol/L柚皮苷对曲格列酮所致DILI明显降低，但1 μmol/L柚皮苷和10 μmol/L柚皮苷改变不明显。同样，100 μmol/L柚皮苷对双氯芬酸钠所致DILI明显降低，但1 μmol/L柚皮苷和10 μmol/L柚皮苷改变不明显(见图2)。

表1 qRT-PCR所检测引物Tab 1 Primers detected by qRT-PCR

2.2 柚皮苷降低转氨酶的作用根据上一步结果，分别选取曲格列酮100 μmol/L和双氯芬酸钠500 μmol/L制造DILI模型，在加入柚皮苷后，DILI HL-7702细胞的AST、ALT明显降低(见图3)。其中1 μmol/L柚皮苷的保护作用不明显(P>0.05)，而10 μmol/L柚皮苷、100 μmol/L柚皮苷的保护作用明显(P<0.05)(见表2～3)。

2.3 柚皮苷减轻凋亡的作用加入柚皮苷后，曲格列酮、双氯芬酸钠所致肝毒性HL-7702细胞的Caspase3基因表达明显降低(见图4)。1 μmol/L柚皮苷组、10 μmol/L柚皮苷、100 μmol/L柚皮苷与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)(见表4)。

表2 不同浓度柚皮苷在降低曲格列酮所致HL-7702细胞肝毒性的转氨酶的作用Tab 2 The effect of naringin on the transaminase induced by Tragllitazone

注：*:与曲格列酮组比较。

图2 柚皮苷减轻药物肝毒性的作用A：不同浓度柚皮苷在减轻不同浓度曲格列酮所致HL-7702细胞的肝毒性中的作用；B：不同浓度柚皮苷在减轻不同浓度双氯芬酸钠所致HL-7702细胞的肝毒性中的作用；C：不同浓度柚皮苷在降低不同浓度曲格列酮所致HL-7702细胞的LDH的作用；D：不同浓度柚皮苷在降低不同浓度双氯芬酸钠所致HL-7702细胞的LDH的作用

Fig 2 The role of naringin in reducing DILIA： the role of different concentrations of naringin in reducing the hepatotoxicity of HL-7702 cells induced by different concentrations of Tragllitazone; B: the role of different concentrations of naringin in reducing the hepatotoxicity of HL-7702 cells induced by different concentrations of Diclofenac sodium; C: the effect of different concentrations of naringin on the LDH of HL-7702 cells induced by different concentrations of Tragllitazone; D: the effect of different concentrations of naringin on the LDH of HL-7702 cells induced by different concentrations of Diclofenac sodium

表3 不同浓度柚皮苷在降低双氯芬酸钠所致HL-7702细胞肝毒性的转氨酶的作用Tab 3 The effect of naringin on the transaminase induced by Diclofenac sodium

注：*:与双氯芬酸钠组比较。

2.4 柚皮苷对于代谢酶基因表达的改变选取与曲格列酮、双氯芬酸钠代谢相关的CYP代谢酶基因表达，分别检测1 μmol/L柚皮苷、10 μmol/L柚皮苷、100 μmol/L柚皮苷对CYP基因表达的改变。通过检测发现，柚皮苷浓度越高，CYP基因改变越明显(见图5、表5)。1 μmol/L柚皮苷对CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP2B6等基因改变差异无统计学意义(P>0.05)，10 μmol/L柚皮苷对CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7等基因表达的改变差异无统计学意义(P>0.05)，但100 μmol/L柚皮苷对所有CYP基因表达的改变差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

肝脏是人体最大的解毒器官，绝大多数药物都具有肝脏毒性，目前根据DILI发病机制的概括总结，药物经磷脂双分子层进入细胞，在CYP450系酶的消化代谢后，所产生的反应性代谢产物(reactive metabolite)会激活ROS、异常自身免疫调节以及炎症反应，导致线粒体、细胞核损伤，继而导致细胞死亡。因此，降低CYP酶功能，可作为预防DILI发生的关键环节[6,11-12]。

图3 不同浓度柚皮苷在降低不同药物所致HL-7702细胞肝毒性的转氨酶的作用 A、B:曲格列酮;C、D:双氯芬酸钠 Fig 3 The effect of naringin on the transaminase induced by different drugs A-B: Tragllitazone; C-D: Diclofenac sodium

图4 不同浓度柚皮苷在降低曲格列酮所致肝毒性HL-7702细胞的Caspace 3的作用A:曲格列酮;B:双氯芬酸钠；

Fig 4 The effect of naringin on the transaminase induced by different drugsA: Tragllitazone; B: Diclofenac sodium；

图5 不同浓度柚皮苷对曲格列酮、双氯芬酸钠代谢相关CYP基因表达的改变的检测

Fig 5 CYP gene expression related to drug metabolism in different concentrations of naringin

表4 不同浓度柚皮苷对降低药物所致肝毒性HL-7702细胞Caspase3基因表达改变的检测Tab 4 The effect of naringin on the Caspase3 gene expression induced by drugs

注：*:与曲格列酮组比较；△ ：与双氯芬酸钠组比较。

对乙酰氨基酚是引起DILI最主要的药物，对于对乙酰氨基酚所引起DILI的机制与防治已有相对全面的研究[13-14]。但除去对乙酰氨基酚，还有很多具有肝毒性的药物，如曲格列酮、双氯芬酸钠等[15-16]，期待更多的机制研究与预防措施的出现。

近年，中医药在预防以及治疗慢性疾病方面逐渐在国内和国际获得认可[17]，在肝病领域，中成药，如肝爽颗粒，已被证实在治疗慢乙肝、肝硬化以及延缓肝病进程方面均可发挥重要的作用[5,18-19]。而有研究发现，作为肝爽颗粒主要成分的柚皮苷，在抑制CYP450家族基因表达方面可发挥重要作用[7-8]。同时也有研究发现，柚皮苷能够通过抑制ROS系统，减轻氧化应激反应而抑制对乙酰氨基酚所致肝损伤[20]。但是对于更多的导致DILI的药物，柚皮苷是否同样能够发挥保护作用？这种保护作用是否与其抑制CYP450家族基因表达有关？

本研究结果显示，柚皮苷能够减轻曲格列酮和双氯芬酸钠所致DILI的损伤，具有降低转氨酶、减少细胞凋亡的作用。但这种改善具有剂量依赖性，其中100 μmol/L柚皮苷的保护作用最明显，1 μmol/L柚皮苷和10 μmol/L柚皮苷的保护作用不明显。比较CYP代谢酶基因改变情况发现，100 μmol/L柚皮苷能够明显抑制其表达，1 μmol/L柚皮苷和10 μmol/L柚皮苷的抑制作用不明显。

综上，肝爽颗粒主要成分柚皮苷能够通过抑制CYP酶的功能，从而起到预防DILI的作用，本次研究期待为临床用药提供依据，也为中药复方制剂和单体的开发和改进提供线索。

表5 不同浓度柚皮苷对曲格列酮、双氯芬酸钠代谢相关CYP基因表达的改变的检测Tab 5 CYP gene expression related to drug metabolism in different concentrations of naringin

注：*:与正常对照组比较。