李佩佩 张小军* 严忠雍 陈 思 张 帅 方 益 龙 举

（1 浙江省海洋水产研究所 浙江舟山316021 2 浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室 浙江舟山316021）

四环素类抗生素（Tetracyclines，TCs）是由链霉菌产生的以十二氢化并四苯为基本骨架（图1）的一类广谱抗生素，主要用于预防、治疗细菌和真菌感染性疾病。因其抗菌谱广、水溶性好、价格低廉等特点而在养殖业中广泛使用。长期以亚治疗剂量添加于动物饲料中，用于预防动物疾病和促进动物生长[1]。我国是TCs 生产、销售和使用大国，2003年我国仅OTC 产量就达到了1 万t，占世界OTC 生产总量的65%[2-3]。TCs 是我国畜禽养殖业中生产量和使用量最多的一类抗生素[1-2]。

由于四环素类抗生素的分子结构中含有多个可离解的官能团，化学性质不稳定，在酸碱等条件下均易发生降解反应，可通过差向异构、脱水以及差向脱水等形式形成相应的代谢产物[4]。如TC、OTC 在pH 值2～6 的弱酸性条件下会发生差向异构化，形成差向四环素和差向土霉素等降解产物；在pH＜2 的酸性或加热条件下会形成脱水四环素和脱水土霉素，这两者又会在弱酸性条件下形成4-差向脱水四环素和α-载脂蛋白土霉素、β-载脂蛋白土霉素等降解产物；TC 在碱性溶液中会降解产生异四环素[1，3]。某些代谢产物，如差向土霉素和4-差向脱水四环素仍具有较大的毒性[5]。四环素类药物能够引起消化道和肝肾损害，引发过敏和中毒反应，影响牙齿和骨骼发育[6]。此外，进入环境中的四环素等抗生素会导致耐药菌被诱发和散播，对人类健康和生态环境构成长期的潜在威胁[7]。

目前关于四环素类抗生素痕量残留的检测方法主要有酶联免疫法[8]、高效液相色谱法[9-11]、高效液相色谱串联质谱法[12-15]等。因具有分析速度快，灵敏度高，选择性和特异性好等优势，液-质谱联用法应用更为广泛。当前国内外的研究多集中于四环素母体，且检测基质多以水体、畜禽动物源食品，如牛奶、鸡蛋、牛鸡羊猪组织为主，对于水产品中四环素药物母体及其代谢产物同时检测的研究并不多见。尽管有适用于水产品的动物源食品中多种四环素类药物液-质谱法检测的国家标准，定量限高，然而仪器检测时间长，大部分药物保留时间在10 min 之后[16]。

图1 四环素类抗生素的基本结构骨架Fig.1 Basic structure skeleton of tetracycline antibiotics

表1 7 种四环素类药物的官能团Table 1 Functional group of 7 tetracycline antibiotics

本文以水产品为样品基质，选择四环素（TC）、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）、强力霉素（DC）和代谢物差向四环素（4-epiTC）、差向土霉素（4-epi-OTC）、差向金霉素（4-epiCTC）7 种应用较多的四环素类抗生素作为代表物质，选择亚2 μm 填料粒径的色谱柱，通过优化前处理方法和质谱参数，选择合适的液相分离条件等建立了同时检测水产品中四环素类抗生素及其代谢产物的超高效液相色谱串联质谱技术，以期为四环素类药物的风险监测提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

四环素盐酸盐（纯度96.5%）、土霉素盐酸盐（纯度95.6%）、金霉素盐酸盐（纯度93.0%）、强力霉素盐酸盐（纯度98.7%），德国Dr.Ehrenstorfer公司；4-epiTC，4-epiOTC，4-epiCTC 3 种四环素 类 代 谢 物 标 准 品，Acros Organics 公 司（Geel，Belgium）。准确称取5.00 mg 左右的标准品，用甲醇溶解并定容至50 mL 后按照各自分子式和纯度计算得到质量浓度为100 μg/mL 左右的标准储备液。磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、一水合柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）均为分析纯，上海国药集团化试剂有限公司。甲醇、乙腈、甲酸均为色谱级，德国Merck 公司。试验用水为Milli-Q 制备超纯水（电阻率≥18.2 MΩ.cm）。

0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液：称取27.6 g Na2HPO4·12H2O、12.9 g 一水合柠檬酸、37.2 g Na2EDTA·2H2O，用水溶解并定容至1 L。必要时用0.1 mol/L HCl 或0.1 mol/L NaOH 调节pH 值至4.0±0.05。

AcquityTM超高效液相色谱仪，UPLC；Quattro Premier XE 串联四极杆质谱仪，美国Waters 公司；MS2 漩 涡 混 合 器，德 国IK 公 司；Centrifuge 5810 高 速 离 心 机，德 国Eppendorf 公 司；N-EVAP112 氮吹仪，美国Organomation 公司；12 通道固相萃取装置，美国Supelco 公司。Waters Oasis HLB 固相萃取柱 （200 mg/6mL），美国Waters 公司；CNW HLB 固相萃取柱（200 mg/6mL），上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱及质谱条件 色谱条件：Waters Acquity UPLC BEH C18柱 （100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；进样量10 μL；样品室温度10 ℃，柱温40℃；流动相：A 为0.1%甲酸溶液，B 为乙腈，梯度洗脱程序如表2所示。

表2 四环素类药物的色谱梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution procedures of TCs

质谱条件：电喷雾离子源；正离子扫描（ESI+）模式分段扫描；多反应监测（MRM）检测方式；毛细管电压：3.5 kV；离子源温度：120 ℃；脱溶剂气温度：380 ℃；锥孔气为高纯氮气，流量：50 L/h；脱溶剂气为高纯氮气，流量：600 L/h。7 种分析物的质谱多反应监测试验条件如表3所示。

表3 7 种四环素药物的多反应监测试验条件Table 3 Conditions of multiple reaction monitoring for 7 TCs

1.2.2 样品处理 从市场上采集的样品按照SC/T 3016-2004《水产品抽样方法》的规定处理后于-18℃密封保存。鱼肉、皮，虾去壳，使用前先解冻。鱼，去鳞、去皮，沿脊背取肌肉；虾，去头、去壳、去肠腺，取肌肉部分；鳖、蟹和贝类，取可食部分，切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的小块后混匀，充分匀浆，-18 ℃以下冷冻保存备用。

称取匀质好的样品 （2.0±0.02）g 置于50 mL具塞离心管中，加入8 mL 0.1 mol/L Na2EDTAMcllvaine 缓冲溶液，涡旋振荡2 min，7 000 r/min离心5 min，移取上清液至50 mL 离心管中，残渣用8 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液重复提取一次，合并提取液并用水定容至20 mL，混匀后用快速滤纸过滤。若滤液仍呈较浓的浑浊状，用离心机7 000 r/min 离心5 min。

HLB 固相萃取柱预先用5 mL 甲醇和5 mL 纯水活化。准确吸取10 mL 提取液过上柱，待样液完全流出后，依次用5 mL 水和5 mL 5%甲醇水溶液淋洗，弃去全部流出液。挤干或减压抽干柱子，用5 mL 甲醇洗脱。收集洗脱液水浴氮吹浓缩至干（温度低于40 ℃），用1.0 mL 初始流动相溶解残渣，用0.22 μm 有机微孔滤膜过滤后供HPLC-MS/MS 分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

由于3 种四环素母体和其代谢物是差向异构体，因此母体和差向代谢物具有相同的分子质量和相似的分子结构，在质谱上的准分子离子和子离子完全相同，若想实现两者的同时准确定量检测，需要色谱具备高效的分离能力。粒径只有1.7 μm 的ACQUITY UPLC BEH C18柱具有超高柱效和较短分离时间的特点，本试验比较了粒径为1.7 μm，长度分别为50 mm 和100 mm 的色谱柱，结果表明，使用50 mm 的色谱柱时，OTC 和EOTC 的色谱峰不能完全分开；而100 mm 的色谱柱可以使OTC 和EOTC 的色谱峰保留时间相差0.27 min，实现有效分离，而各个分析物的保留时间也只比50 mm 的柱子长0.5～1 min，因此选择后者。水相中加入甲酸可以提高分离度和离子化效率，通过优化梯度洗脱程序使所有分析物在8 min 内完全出峰，分离良好，峰形尖锐，响应值较高。大大缩短了分析时间。

2.2 质谱条件优化

在MRM 正离子扫描模式下将7 种四环素类抗生素的单标准工作液通过蠕动泵直接流动注射进样，通过一级质谱全扫描分析，确定准分子离子[M+H]+，调试选择最佳锥孔电压和毛细管电压，然后对准分子离子进行轰击获得二次碎裂的子离子，并对碰撞能量等质谱参数进行优化，选择最强和次强的两个离子分别作为定量离子和定性离子，与将准分子离子组成监测离子对。母体和代谢物具有完全相同的质谱参数。最终确定的质谱参数见表2。四环素类药物准分子离子可生成的主要碎片离子有[M+H-NH3]+、[M+H-H2O]+和[M+HNH3-H2O]+，通过优化碰撞能量，发现在3 种四环素类母体及其差向异构体分子离子的裂解碎片中，[M+H-NH3-H2O]+碎片离子均丰度较大，即裂解丢失分子质量为35 的子离子均具有较高的相应强度，可作为定量离子。如TC、OTC、CTC 的母离子分别为445.1，461.1，479.1，定量离子分别为410，426，443.9。

质谱同时监测多种分析物时，每种分析物的线性关系会因为同时监测的物质种类多而变差，不利于准确定量。因此试验根据分析物的保留时间设定质谱分段扫描，以增加采集点数，使分析物峰形平滑且更对称，有助于保证良好的线性关系。7 种分析物的MRM 谱图见图2。

图2 质量浓度为20 ng/mL 的7 种四环素药物混合标准溶液的MRM 图Fig.2 MRM chromatograms of 7 TCs mixed standard solution with the mass concentration of 20 ng/mL

2.3 前处理条件的选择

四环素类药物分子中含有亲水的羟基，易溶于水溶液等极性溶剂，较难溶于非极性的有机溶剂[17]，且四环素类药物与蛋白质结合能力强，所以需用强酸或酸性脱蛋白剂从生物样品中提取。四环素类药物在强酸性条件下易降解为脱水产物，加热时易转变为差向异构体，因此对于生物基质包括水产品中四环素类药物的提取多数研究均采用弱酸性的Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液。Na2EDTA 的加入可以有效降低四环素类药物与金属离子的螯合作用，提高分析物提取效率。然而，Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液不易沉淀蛋白质，提取液浑浊，脂肪等杂质含量多，不利于净化。实现有效净化十分关键。本文通过减少称样量，滤纸过滤，离心机高速离心，降低上柱液体积等方式对提取液进行预净化。试验选择吸附容量高，适用酸碱范围广的HLB 固相萃取柱进行净化。试验比较了不同品牌的HLB 柱。研究发现对于四环素类提取液，适合用装填填料比较松散的HLB 柱。而填料比较紧实的HLB 柱会导致上柱液堵住。如Waters Oasis HLB 柱和国内某品牌的HLB 柱相比，同样是200 mg 填料，6 mL 柱容量，填料高度上某品牌的是Waters Oasis HLB 柱的近2 倍。

2.4 线性范围和检出限

在设定好的仪器条件下，将7种分析物的混合标准溶液配制成质量浓度为2，5，10，20，50，100，200 ng/mL 的标准工作溶液系列进UPLCMS/MS 测定。以定量离子的峰面积对质量浓度进行线性回归，绘制标准曲线。结果表明ETC、ECTC和EOTC 在5～200 ng/mL 质量浓度范围内，CTC、OTC、TC 和DC 在2～200 ng/mL 质量浓度范围内相关系数均大于0.995，满足仪器分析的需要。取阴性样品按照1.2 节试验方法前处理后添加一定浓度的7 种分析物混合标准使用液上机检测，以10 倍信噪比计算得到EOTC、ETC 和ECTC 的定量限（LOQ）为5.0 μg/kg；CTC、OTC、TC 和DC 的定量限为2.0 μg/kg。

2.5 方法回收率和精密度

以阴性草鱼、大黄鱼、对虾样品为空白基质进行添加回收试验，考察方法的准确度和精密度（表4）。结果表明7 种四环素药物的平均回收率为70.3%～90.5%，相对标准偏差（RSD）为5.5%～11%，方法的精密度和准确度可满足分析检测要求。

表4 空白试样添加回收率和精密度测定结果（n=6）Table 4 Results of recovery and precision of spiked samples （n=6）

2.6 实际样品分析

为考察方法的适用性和实用性，将本研究建立的方法应用于英国Fapas 实验室能力验证计划四环素类兽药残留考试中，考核基质为鱼肉。加入的四环素类药物包括本方法中7 种目标物的一种或几种。检测结果显示鱼肉中含有OTC、TC、ETC，含量分别为115，113，38.6 μg/kg。与统计结果相比，z 值均小于1.0，表明定性和定量结果均准确。检测结果的MRM 图见图3。另将方法应用于国家认监委能力验证两组虾肉样品中四环素含量测定考试，四环素测试结果与指定值的z 分别为0.77和0.36，回收率均为80%以上，结果为满意。表明此方法可以应用于实际样品的检测。采用本方法检测了浙江海水养殖的大黄鱼、对虾、黄姑鱼、鲈鱼、黑鲷、三疣梭子蟹等30 份海产品和鳙鱼、草鱼、鲫鱼、鲢鱼、牛蛙、泥鳅、青鱼等40 份中四环素类抗生素的残留量，结果未检出以上7 种四环素类药物。

图3 FAPAS 能力验证计划考核样品的MRM 图Fig.3 MRM chromatograms of FAPAS proficiency testing sample

3 结论

本试验建立了超高效液相色谱-串联质谱同时测定水产品中7 种四环素类原药及其代谢产物的方法。利用色谱的差速迁移技术和质谱的分段扫描方法，通过合适的梯度洗脱条件，联合色谱的高效分离和串联质谱的高选择性，成功实现了四环素母体和差向异构体的快速有效分离和准确定量。通过选择合适的HLB 固相萃取柱以及淋洗和洗脱条件保证了分析物的回收率和精密度。方法灵敏度高，回收率和精密度良好，且分析速度快，适用于水产品中四环素类药物的同时测定。