张 琪，李白坤，朱继民，刘竹青，苏婧婧，李庆林

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥 230012；3.安徽中医药大学针灸推拿学院，安徽 合肥 230012；4.安徽中医药大学科研实验中心，安徽 合肥 230038)

药物流产后冲任虚损，形体多虚多瘀，恶露排出不净，瘀阻冲任，瘀血停积，阻碍新血归经。基于中医“瘀血不去、新血不生”治则，对产后血瘀证可用祛瘀生新法进行治疗。许多研究已证实，桃红四物汤对于妇科血瘀证疗效显著[1-2]。现代医学研究表明，流产后子宫内膜修复是减少产后子宫出血的重要环节，而子宫修复与子宫内膜血瘀状态改善和子宫内膜血管新生密切相关[3]。内皮素-1(endothelin-1，ET-1)是迄今为止发现的作用最强的缩血管物质，其与一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)皆可通过影响血管内皮的舒缩功能进而影响血瘀状态[4-5]。诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是NOS的一种亚型。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)具有显著的诱导血管新生作用，与子宫内膜修复有关[6]；血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)主要分布于血管内皮表面，是可与VEGF进行特异性结合的高亲和力受体，调节血管的生成。本研究旨在通过动物实验，观察桃红四物汤对产后血瘀子宫的修复作用，探讨其与ET-1、iNOS、VEGF和VEGFR-2的关联性，为桃红四物汤的作用机制研究奠定基础。

1 材料

1.1 动物 SPF级健康SD大鼠100只，其中雌性70只、雄性30只，鼠龄10周，体质量220～250 g，由上海杰思捷实验动物有限公司[动物生产许可证号为SCXK(沪)2013-0006]提供，常规饲养。本实验获得安徽中医药大学实验动物伦理委员会的批准。

1.2 药物 ①桃红四物汤提取液的制备：桃红四物汤(桃仁、当归、白芍各9 g，红花、川芎各6 g，熟地黄12 g)药材购自合肥乐家老铺中药饮片有限公司，加入10倍量(容积与质量比)75%乙醇冷凝回流提取2 h后，倒出药液，然后再用8倍量75%乙醇冷凝回流提取2 h，合并2次提取液，浓缩至含生药含量为1.8 g/mL的提取液[7]。②益母草颗粒(国药准字Z45021652，批号170107)购自广西禅方药业有限公司；米非司酮片(国药准字H20033551，批号151201)购自湖北葛店人福药业有限公司；米索前列醇(国药准字H20000668，批号43160403)购自华润紫竹药业有限公司。

1.3 试剂与主要仪器 iNOS、ET-1及VEGF酶联免疫吸附试验试剂盒(批号均为201709)：上海碧云天生物科技有限公司；VEGFR-2抗体(批号ATQAU2306)：Abbkine公司；鼠抗(批号17042104)：北京中杉金桥生物技术有限公司。ELX800uv酶标仪：Bio-TEK公司；CK2型倒置显微镜：日本Olympus公司。

2 方法

2.1 模型复制与给药 适应性饲养1周后，随机留取8只雌性大鼠作为正常对照组，取雌鼠60只、雄鼠30只，于20：00以2∶1将其合笼，次日6：00进行阴道栓和阴道涂片镜检，以发现阴道栓和精子的当天为妊娠第1天。于妊娠第7天分别灌胃米非司酮(8.3 mg/kg，8：00)和米索前列醇(0.1 mg/kg，18:00)，给药米索前列醇后向鼠阴道塞入适合大小的棉球。次日8：00和20：00取出棉球，若观察到棉球上有血则判为早孕大鼠药物流产[8]。大鼠流产第2天从眼内眦取血，肝素抗凝后，检测血液流变学指标变化；若全血黏度在低切(1 s-1)≥45 mPa·s、高切(200 s-1)≥4.5 mPa·s则为血液流变性异常，按照文献[3]方法判断产后血瘀模型是否复制成功。选取模型复制成功的大鼠40只，随机分为5组，每组8只，即桃红四物汤高剂量(18.0 g/kg)、中剂量(9.0 g/kg)、低剂量(4.5 g/kg，相当于成人临床用量的5倍)组，阳性对照组(益母草颗粒4.3 g/kg)和模型组(蒸馏水)；正常对照组给予蒸馏水。自由饮食，采用灌胃方式给药(10 mL/kg)，每日2次，连续7 d。

2.2 指标观察方法

2.2.1 子宫形态观察与VEGFR-2检测 末次给药1 h后，用3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取出大鼠子宫组织拍照后用10%甲醛固定，经过石蜡包埋，切片，行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，观察大鼠的子宫形态学改变；然后按免疫组织化学试剂盒的要求，对切片进行免疫组织化学实验，借助显微镜观察大鼠子宫VEGFR-2的表达情况。

2.2.2 血清指标检测 采集子宫组织的同时，腹主动脉取血，离心后吸取血清，采用ELISA试剂盒，借助ELX800uv酶标仪检测iNOS、ET-1及VEGF水平。

3 结果

3.1 桃红四物汤对大鼠子宫形态的影响 各组大鼠子宫的大体形态见文献[9]。与正常对照组比较，模型组大鼠子宫色泽较暗，有水肿感，各给药组大鼠子宫的色泽较模型组红润。HE染色后镜下观察子宫形态，发现正常对照组大鼠子宫内膜腺体较大，间质无水肿，无充血，管腔内无红细胞聚集；模型组大鼠子宫内膜腺体较小，间质稍显水肿，有充血，管腔内有红细胞聚集；各治疗组大鼠子宫内膜充血和水肿等血瘀表现较模型组好转。见图1。

注：A.正常对照组；B.模型组；C.桃红四物汤低剂量组；D.桃红四物汤中剂量组；E.桃红四物汤高剂量组；F.阳性对照组

图1各组大鼠子宫组织形态学变化比较(HE染色，10×10倍)

3.2 桃红四物汤对大鼠子宫VEGFR-2表达的影响 免疫组织化学染色后，子宫内膜中血管内皮细胞内表达的VEGFR-2被染成棕黄色；镜下观察发现正常对照组的棕黄色颗粒明显多于模型组，各剂量组的棕黄色颗粒较模型组明显增多。见图2。

3.3 桃红四物汤对大鼠血清VEGF、ET-1及iNOS水平的影响 模型组VEGF及iNOS均低于正常对照组(VEGF：t=9.587，P=0.000；iNOS：t=5.814，P=0.000)，但模型组ET-1高于正常对照组(t=-6.465，P=0.000)；各给药组VEGF、iNOS及ET-1水平的差异均有统计学意义[VEGF：F(4，35)=55.774，P=0.000；iNOS：F(4，35)=7.726，P=0.000；ET-1：F(4，35)=11.304，P=0.000]，且与模型组相比，桃红四物汤中剂量、高剂量组和阳性对照组VEGF及ET-1水平均明显升高(P<0.05)，而iNOS水平则相对降低(P<0.05)，但桃红四物汤低剂量组与模型组iNOS及ET-1水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

注：A.正常对照组；B.模型组；C.桃红四物汤低剂量组；D.桃红四物汤中剂量组；E.桃红四物汤高剂量组；F.阳性对照组

图2各组大鼠子宫组织VEGFR-2表达水平比较(免疫组织化学染色，10×20倍)

4 讨论

桃红四物汤能显著改善产后血瘀状态已为众多临床观察和动物实验[3,10-11]证实，其作用机制可能与调节NO、ET-1、VEGF、Ang-1、Ang-2等物质的表达水平有关[3,10,12-13]。但桃红四物汤改善产后血瘀的作用是否与iNOS及VEGFR-2的表达水平有关尚未见报道。

本研究将VEGF与VEGFR-2组合，考察桃红四物汤改善产后血瘀的作用是否与促进血管新生有关；将ET-1与iNOS组合，考察桃红四物汤改善产后血瘀状态是否与调节血管舒缩功能有关；从形态学和分子生物学的角度初步探讨桃红四物汤对产后血瘀子宫的修复作用，并从血管舒缩功能调节及血管新生的角度分析该复方促进血瘀子宫修复的可能机制。研究发现，桃红四物汤具有显著促进产后血瘀证大鼠子宫修复的作用，且该作用可能与桃红四物汤下调血清ET-1的水平，上调iNOS水平，进而直接减弱血管收缩功能，间接增强血管舒张功能[8]，以及上调VEGF及VEGFR-2而发挥促进血管新生有关，结果与同类研究类似[3,12-13]。

表1 各组大鼠血清VEGF、ET-1及iNOS水平比较

注：与正常对照组比较；*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

桃红四物汤源自清代吴谦等所著的《医宗金鉴》，是中医经典名方，由桃仁、当归、白芍、红花、川芎、熟地黄6味中药组成。桃仁、红花入血分，活血化瘀；川芎行血中之气，行血活血；当归活血补血；白芍养血柔肝，缓急止痛；熟地黄补血滋阴。诸药合用，有活血化瘀、养血调经之效。本研究提示，桃红四物汤促进产后血瘀大鼠子宫修复的作用可能与血清iNOS的水平及子宫组织VEGFR-2的表达水平有关，为进一步阐明桃红四物汤的祛瘀生新作用机制提供参考。