王瑞雪，董小鹏，储继军

(安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031)

复发性流产(repeated spontaneous abortion，RSA)是指3次或3次以上妊娠28周之前的胚胎或胎儿丢失。中医学称之为“数堕胎”或“滑胎”。RSA是一种常见妊娠并发疾病，据估计，人类妊娠中自然流产的发生率为50%～60%，RSA在育龄妇女中发病率为1%～5%[1]。RSA已经成为严重影响妇女生殖健康与安全的疾病，流产次数越多其复发风险越高。引起RSA的原因较多，可能包括先天遗传、女性解剖异常、内分泌紊乱、盆腔感染因素、男性因素、心理因素及免疫因素等，但其确切机制尚未明了。细胞的功能起始于基因的表达，转录组概念上是指在某一时间阶段个体细胞内所有基因转录形成的RNA的总称[2]。对转录组的分析可以获得高通量基因表达的RNA相关信息，从而揭示基因表达与某种生命现象之间的关系[3]。中医的“证”，是对疾病过程中机体整体动态的阶段性病理特征之概括，是人体整体病理状态的实时反映，而这种状态又是复杂多变的[4-5]。研究认为微小RNA(microRNA，miRNA)表达具有时序性、特异性，这种表达特点与中医证候的上述特性相吻合，miRNA表达异常引起的相应基因网络调控紊乱常常是导致疾病发生的重要内在原因[6]。因此，从miRNA调控角度研究正常妊娠和RSA肾虚证miRNA表达之间的相关性，探索RSA肾虚证和正常妊娠小鼠子宫蜕膜组织的miRNA差异表达谱，可能为该病的中医辨证分型更加规范和客观化提供依据。

1 材料

1.1 动物 采用SPF级CBA/J小鼠，6～7周龄，体质量(25±5)g，共25只；SPF级DBA/2小鼠，6～7周龄，体质量(25±5)g，共10只；SPF级BALB/c小鼠，6～7周龄，体质量(25±5)g，共3只。以上小鼠均由重庆恩斯维尔生物科技有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK(渝)2017-0003]提供，在SPF级实验室适应1周。

1.2 主要试剂和仪器 高速台式离心机(BACKMAN CS-15R)：美国Beckman公司；实时荧光定量PCR仪：加拿大Funglyn Biotech；电泳仪：美国Bio-rad；凝胶成像仪稳压DNA电泳仪：美国Tianneng；GDS8000凝胶扫描系统：美国UVP；高速台式离心机(BACKMAN CS-15R)：美国Beckman公司；水合氯醛：上海Aladdin；羟基脲：齐鲁制药有限公司；补肾安胎冲剂：安徽中医药大学第一附属医院院内制剂。

2 方法

2.1 模型复制 采用具有隐性、反复性和父系特异性特征的DBA/2小鼠×CBA /J小鼠的Clark经典RSA小鼠模型[7]。RSA模型复制方法：将雌性CBA/J小鼠与雄性DBA/2按2∶1的比例于拟交配日18:00合笼，次日早上8:30检查阴道栓。正常妊娠模型复制方法：将雌性CBA/J小鼠与BALB/c小鼠按2∶1的比例于拟交配日18:00合笼，次日早上8:30检查阴道栓，肉眼观察阴道口有无乳白色、固态胶状物，发现明显阴栓者为阳性。检出阴栓的CBA/J小鼠计为妊娠第0天，进入下一步实验。模型复制成功后小鼠分为两组：正常对照组(正常妊娠小鼠)：予10 μL/g NaCl灌胃；模型组(RSA肾虚证小鼠)：妊娠第1～7天每日给予羟基脲450 mg/kg灌胃(药物浓度为45 mg/mL，灌胃剂量10 mL/kg)+10 mL/kg NaCl灌胃；每组小鼠5只，共10只。注意观察各组CBA/J小鼠一般状态，每4 d称量体质量，测量饮水和饲料1次并记录。各组CBA/J小鼠腹腔注射麻醉并解剖后观察子宫形态、颜色、宫口、宫腔内变化并记录数据，剖视子宫观察胚胎丢失情况并计算流产率；分离出各组子宫蜕膜组织，冰PBS缓冲液洗净，-80 ℃保存用于后续检测。

2.2 小鼠子宫蜕膜组织提取及RNA芯片处理 对正常妊娠小鼠(样本编号A)及RSA肾虚证小鼠子宫蜕膜组织(样本编号B)RNA的提取及纯化步骤按AMBION抽提试剂盒使用说明书进行，样品检测结果均为A级合格，可进行下一步实验。

2.3 RNA标记与芯片杂交 取100 ng总RNA，定容至2 μL。①配制去磷酸化混合液(CIP Master Mix)。PCR反应：37 ℃，30 min；样品变性：在每管样品中添加2.8 μL 100% DMSO混匀离心，将上述反应混合液置于100 ℃ PCR仪中5～10 min，再迅速转入冰水浴中冷却；连接标记：将10×T4 RNA Ligase Buffer置于37 ℃温育并间隔涡旋，直至沉淀全部溶解，然后将其冷却至室温备用。②配制连接反应混合液(Ligation Master Mix)。PCR反应：16 ℃温育2 h；标记后RNA纯化，纯化后样品抽干，准备10×阻滞剂(Blocking Agent)。③配置反应体系(Hybridization Mix)。反应条件设置：100 ℃，5 min ；冰水5 min；上芯片，55 ℃ 20 h，20 r/min滚动杂交。④芯片洗涤：取出芯片洗涤，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)扫描得到原始图像。

2.4 实时荧光定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)验证筛选出的miRNA 采用相对定量法对结果进行比较分析，以U6 RNA作为内参。首先进行RNA的提取，按照qRT-PCR的操作步骤，进行反转录反应条件设置：25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min；荧光定量PCR扩增条件设置：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循环35次，72 ℃检测信号。每个标本均采用3个复孔。

2.5 生物信息学分析方法 采用Feature Extraction 软件 (Version 10.7.1.1，Agilent Technologies)处理原始图像，提取原始数据。然后利用Genespring软件(Version 13.1，Agilent Technologies)进行标准化过滤数据和后续数据统计。将至少有一组100%标记为“Detected”的探针筛选保留做下一步分析，对于无生物学重复者仅利用差异倍数值进行筛选，标准是差异倍数值≥2.0。然后应用3个数据库(Targetscan，microRNAorg，pita)共同对差异miRNA进行靶基因预测，接着对所预测的靶基因进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析和基因本体(Gene Ontology，GO)分析，以判定差异miRNA所影响的细胞分子通路或者生物学功能。qRT-PCR验证结果采用SPSS 17.0软件进行两个独立样本t检验，若P<0.05则视为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 RSA肾虚证小鼠子宫蜕膜组织表达上调倍数≥2的miRNA 与正常对照组比较，模型组子宫蜕膜组织表达上调倍数≥2的miRNA共有22条。见表1。

表1 RSA肾虚证小鼠子宫蜕膜组织表达上调倍数≥2的miRNA

3.2 RSA肾虚证小鼠子宫蜕膜中表达下调倍数≥2的miRNA 与正常对照组比较，模型组小鼠蜕膜中表达下调倍数≥2的miRNA共41个。见表2。

3.3 靶基因预测 从检测出的差异表达的miRNA中选取变化较为明显的14个miRNA(mmu-miR-7235-5p、mmu-miR-146a-5p、mmu-miR-155-5p、mmu-miR-185-5p、mmu-miR-192-5p、mmu-miR-202-3p、mmu-miR-328-3p、mmu-miR-34b-5p、mmu-miR-34c-5p、mmu-miR-483-5p、mmu-miR-676-3p、mmu-miR-700-3p、mmu-miR-872-5、mmu-miR-92b-3p)，通过3个数据库(Targetscan，microRNAorg，pita)，共同对差异miRNA进行靶基因预测，结合既往自然流产基因检测研究中证实的相关基因，共筛选出3 401个预测靶基因；分别选取其中上调的3个miRNA、下调的3个miRNA，列出其预测的部分靶基因。见表3。

3.4 qRT-PCR验证结果 根据miRNA表达谱芯片检测的结果，选取miR-92b-3p用实时荧光定量PCR再次验证，逆转录引物：GCGCGTGAGCAGGCTGGAGAAATTAACCACGCGCGGAGGC，结果显示其变化趋势与芯片法的结果是吻合的，表明miRNA芯片检测结果真实有效；熔解曲线显示单峰者表明产物特异性良好。见表4。

3.5 GO分析 应用GO数据库，针对靶基因作进一步功能富集分析，获得差异miRNA 靶基因总数，对应的靶基因的显著性基因功能的筛选以P<0.01为标准，富集积分(enrichment score)=-log10(P值)[8]。这些靶基因主要富集在转录调控、DNA模板化、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的阳性调控、多细胞生物发育、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的负调控以及蛋白转导等多个生物过程方面。

3.6 KEGG通路富集分析 对这些靶基因进行调控通路分析，计算的结果会返回一个富集显著性的P值，越小的P值表明靶基因在该通路中富集表达。以P<0.01为标准，Enrichment Score=-log10(P值)。排列在前20个显著富集的KEGG通路表明，这些miRNA的异常表达可能与癌症通路、PI3K-Akt信号通路、细胞吞噬、肌动蛋白细胞骨架调控、黏着斑、轴突导向信号通路、MAPK信号通路、PAP-1信号通路等的激活有关。

4 讨论

RSA是一种常见的妊娠并发疾病，其确切发病机制尚不十分明确。miRNAs是一组内源性的非编码性RNA，是一类新发现的生物基因表达调控因子，其长度为19～24个核苷酸[9]。人类基因组中总共有1 048条miRNA，这些miRNA可以调控超过30%的基因，从而参与调控机体生长发育等许多复杂的生命过程。也就是说，一个mRNA可以接受多个miRNA调控，单个miRNA也可以调控多个mRNA[10]。这种现象表明miRNA分子是基因调控网络中的核心组成部分。最近的研究更进一步发现miRNA失调与人类癌症发生之间有密切的联系[11]。而胚胎携带父系遗传物质，相对于母体属于“外来的”半同种移植物却可被母体容受，胚胎着床于子宫的过程类似于肿瘤对机体的侵袭过程。有研究证明，在胚胎发育过程中miRNA具体重要作用[12]。如谭彬等[13]检测了自然流产模型小鼠与正常妊娠小鼠子宫蜕膜组织差异表达的miRNAs，利用miRNAs芯片数据发现小鼠流产蜕膜组织和正常蜕膜组织之间有13个miRNAs存在明显表达差异，预测软件显示miR-21和miR-26a的靶基因分别是和妊娠相关的金属蛋白酶抑制因子RECK和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)两个因子，因此认为小鼠子宫蜕膜组织miR-21和miR-26a的差异性表达可能在小鼠胚胎自然流产过程中具体关键作用。李怡等[14]研究认为，miR-10b可能促进了滋养细胞浸润功能，参与了早期自然流产的病理过程。WANG等[15]发现miR-133a在自然流产中具体重要作用，推测miR-133a可能是通过抑制HLA-G的翻译过程而参与了自然流产这一事件的发生。HU Y等[16]研究报道，pri-miR-125a的A-T单体型突变降低了miR-125a表达量，从而减弱了对靶基因LIF受体和ERBB2的有效抑制，可能与习惯性流产患者易患性有关。余秋波等[17]利用U133 plus 2.0芯片对自然流产绒毛和正常绒毛组织中绒毛外滋养细胞EVTs的基因表达谱进行检测，发现与正常EVTs相比，在自然流产EVTs中，发现显著上调基因219个，下调基因293个，认为与滋养层细胞粘附、免疫应答、水解酶及凋亡等相关基因的差异表达可能与滋养细胞侵袭行为变化及自流产有关。miRNA及其调节的特性与中医治病求本机制有着密切的关联性[18]。

中医辨证论治因其确切稳定的疗效，被广泛应用于滑胎的治疗。肾藏精，主生殖，为“先天之本”，肾气肾精充足旺盛对女性生殖能力至关重要，是胞胎能够在子宫正常着床发育的前提。张锡纯《医学衷中参西录》云：“男女生育，皆赖肾气作强，肾旺自能荫胎也。”故“肾可系胎”，肾气肾精亏虚常常引起自然流产甚至RSA。中医公认肾虚证是滑胎的主要证型，现代著名中医妇科医家罗颂平亦认为肾虚不能固摄、肾气亏虚是导致滑胎的主要病因，气血、冲任二脉的耗损是其主要病机。

表2 RSA肾虚证小鼠子宫蜕膜组织表达下调倍数≥2的miRNA

表3 RSA肾虚证小鼠差异表达倍数≥2的miRNA及其预测靶基因

表4 正常妊娠小鼠与RSA肾虚证小鼠蜕膜miR-92b-3p表达水平比较

注：ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct；相对表达量=2(-ΔCt)；相对比值=目的基因相对拷贝数/内参基因相对拷贝数；与正常对照组比较，*P<0.05

本研究通过差异基因筛选寻找出63条表达显著的差异基因，由于本研究中异常调节的miRNA所调控的靶基因较多，通过对miRNA所调控的靶基因进行GO分析，构建RSA蜕膜组织差异miRNA与靶基因功能调控网络，得出处于网络核心调控位置的miRNA所调控的靶基因进行GO分析，构建RSA蜕膜组织差异miRNA与靶基因功能调控网络，得出处于网络核心调控位置的miRNA、被调控的核心靶基因以及多个关键性基因功能。上述差异基因表达产物通过各种方式影响了转录调控、DNA模板化、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的阳性调控、多细胞生物发育、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的负调控、蛋白转导等多种生物学过程，其中又涉及多种信号通路的改变，如癌症通路、PI3K-Akt信号通路、细胞吞噬、肌动蛋白细胞骨架调控、黏着斑、轴突导向信号通路、MAPK信号通路、PAP-1信号通路等。这一结果证实了RSA肾虚证的形成可能是由其基因表达异常，进一步引起机体多种细胞生物学反应的复杂化多样化过程。

本研究从基因水平展开研究，结果初步显示两个证型间存在着差异表达基因谱，这也说明中医临床证型的分类具有特定的生理指标和特定的差异表达基因的依据[2]。因本研究的样本量仍不够大，其结果还有待下一步扩大样本量进行验证，从而为阐明中医“证”本质提供更加客观的生物学标志物，亦有利于深入了解中药在RSA治疗中的分子和基因调控机制。