陈大光，曹 晖，李 令，吴东升，刘震宇，陈鸿飞，田 娜

(湖南中医药大学，湖南 长沙 410007)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，常以腹痛、腹泻和黏液脓血便反复发作为临床表现[1]。本病属于中医学“痢疾”“休息痢”“泄泻”“肠澼”范畴，基本病机为脾失健运、湿热内生、内蕴肠腑、气血瘀滞。因此，在治疗上应以清热燥湿、调和气血为主。芍药汤为古今临床治疗本病的经验方[2]，有清热燥湿解毒、调气和血、促进肠道溃疡愈合的作用，临床疗效显著，但是其作用机制尚未明确。本研究旨在基于结肠组织机械屏障和炎症细胞因子角度，探讨芍药汤治疗UC的作用机制。

1 材料

1.1 动物 41只SD大鼠，雌性20只，雄性21只，体质量(150±20)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[动物生产许可证号：SCXK(湘)2016-0002]。分笼饲养于湖南中医药大学第一附属医院动物中心实验室，饲养温度为24～26℃，湿度为50%～70%。

1.2 药物 ①芍药汤按邓中甲主编的《方剂学》[2]中确定的药物组成和剂量：芍药30 g，当归、黄连、黄芩各15 g，大黄9 g，槟榔、木香、炙甘草各6 g，肉桂5 g。所有中药饮片均购自于湖南中医药大学第一附属医院药房，经水煎煮2次，混合过滤后，浓缩制备成含药浓度为1 g/mL的药液，经灭菌后置于冰箱中4 ℃保存备用。②对照药物：美沙拉嗪缓释颗粒剂(批号 H20143164，上海爱的发制药有限公司)，用9.0 g/L氯化钠注射液配成21 mg/mL的溶液备用。③用于复制模型的药物：2，4，6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)，美国Sigma;50%乙醇。

1.3 主要仪器 Leica UC7超薄切片机：德国Leica；Ultra 45°钻石切片刀：瑞士Daitome；HT7700透射电子显微镜：日本Hitachi；其他所需耗材均为国产。

1.4 主要试剂 肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)试剂盒(批号 201803)、白细胞介素-4(interleukin-4, IL-4)试剂盒(批号 201803)、内毒素(endotoxin, ET)试剂盒(批号 201803)：武汉基因美生物技术有限公司；电镜固定液(货号 G1102)：武汉赛维尔生物科技有限公司；812包埋剂(货号 90529-77-4)：美国SPI；其他试剂均为国产。

2 方法

2.1 UC模型复制与动物分组 按照文献[3]的方法，采用TNBS/乙醇法复制UC模型。大鼠适应性饲养3 d后，随机抽取31只大鼠(雌性15只，雄性16只)，禁食、不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉成功后，采取头低脚高位，将直径约2 mm聚乙烯管，自肛门缓慢插入直肠约8 cm，灌入TNBS原液100 mg/kg+50%乙醇0.25 mL，取头低尾高位，呈20°～30°角，持续30 s，放置笼中，清醒后自由饮食，及时观察大鼠情况。

将31只UC模型复制成功的大鼠随机分为3组：模型组(n=10)、美沙拉嗪组(n=10)、芍药汤组(n=11)，剩余10只为空白对照组。4组均以普通饲料喂养，饮用蒸馏水。模型复制后第7天，空白对照组、模型组各随机抽取2只大鼠剪取结肠组织病理切片后进行模型评价。第8天开始，对各组大鼠进行灌胃给药，每日1次，连续1周。美沙拉嗪组每日给予美沙拉嗪混悬液0.42 g/kg灌胃。芍药汤组每日给予芍药汤浓缩液11.24 g/kg，每次灌胃容积均为3 mL。空白对照组、模型组大鼠均灌胃生理盐水3 mL。灌胃给药7 d后，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)将动物麻醉，无菌操作，经腹正中线剖腹，从腹主动脉取血，立即全血离心(3 000 r/min)2 min后分装血清，-80 ℃冰箱保存备用。于肛门上端8 cm处，剪取病变结肠组织约2 cm，纵向剖开，生理盐水清洗，备用。

2.2 观察指标

2.2.1 一般情况观察 实验开始后每天观察大鼠体质量、血便情况、泄泻程度、UC活动指标等，并按文献[4]方法进行疾病活动指数(disease activity index, DAI)评分。

2.2.2 DAI评分 包括体质量下降情况、大便性状和血便。①体质量下降0，计0分；下降1%～5%，计1分；下降5%～10%，计2分；下降10%～15%，计3分；下降15%以上，计4分。②大便性状：正常，计0分；大便松散，计2分；稀便，计4分。血便：无血便，计0分。③大便隐血：阳性，计2分；肉眼血便，计4分。

2.2.3 结肠组织形态学观察 环形切取结肠组织1 cm，采用4%多聚甲醛溶液进行固定，石蜡包埋制片，切片脱蜡处理后进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色。用显微镜观察切片标本有无溃疡面、充血、肠绒毛排列情况以及炎症细胞浸润等变化。按照病理组织学评分标准[5]对结肠组织形态进行评分：结肠组织无明显损伤，计0分；损伤表面上皮，计1分；黏膜层溃疡，固有层炎症细胞浸润，黏膜下层水肿，计2分；透壁性炎症和溃疡，上皮变形坏死脱落，计3分；透壁性炎症和溃疡，略见正常黏膜，计4分；透壁性炎症和溃疡，无正常黏膜，计5分。

2.2.4 血清TNF-α、IL-4和ET表达水平检测 采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-4和ET表达水平。

2.2.5 结肠组织紧密连接 透射电镜下观察结肠组织紧密连接形态，包括紧密连接连续性、扩张程度及染色情况。

3 结果

3.1 各组UC大鼠一般情况比较 空白对照组大鼠自由饮食，排便正常，无黏液脓血便，体质量持续上升。模型复制第2天开始，模型组、美沙拉嗪组、芍药汤组大鼠均出现黏液血便，精神不振，食量下降，毛发散乱，体质量逐渐下降。模型复制3 d后，大鼠体质量下降至最低点，可见稀便，肉眼可见少量血丝、黏液。模型复制7 d，从空白对照组、模型组各随机抽取2只大鼠，取结肠组织，作病理切片后进行模型评价。模型复制9 d，灌胃失误致模型组1只大鼠死亡。给药后美沙拉嗪组、芍药汤组大鼠体质量逐渐回升，大便黏液肉眼血便减少，逐渐成形，进食增加，精神和毛发情况逐渐好转。与模型组比较，美沙拉嗪组、芍药汤组DAI评分显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，表明美沙拉嗪组、芍药汤组大鼠临床症状较模型组减轻；美沙拉嗪组与芍药汤组DAI比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示美沙拉嗪与芍药汤在缓解临床症状方面作用相当。见图1。

注：A.空白对照组(n=8)；B.模型组(n=7)；C.美沙拉嗪组(n=10)；D.芍药汤组(n=11)；与模型组比较，*P<0.05

图1各组UC大鼠DAI评分比较

3.2 各组大鼠结肠组织形态学变化比较

3.2.1 肉眼下各组大鼠结肠组织形态学变化比较 空白对照组大鼠结肠组织颜色淡红，黏膜连续完整，无明显充血水肿及溃疡；模型组大鼠结肠组织距肛门7 cm处颜色发黑，伴有明显的溃疡面；美沙拉嗪组及芍药汤组结肠组织7 cm以下可见黏膜充血，无明显溃疡面。见图2。

图2肉眼下各组大鼠结肠黏膜形态比较

3.2.2 光镜下各组大鼠结肠组织形态学变化比较 空白对照组大鼠结肠上皮组织均完整，组织结构正常，无炎症细胞浸润；模型组黏膜层欠完整，可见一溃疡面深达肌层，腺体排列不规则，大量炎症细胞浸润及明显毛细血管扩张充血；美沙拉嗪组、芍药汤组大鼠结肠组织上皮尚完整，黏膜层稍有缺损，无深达肌层的溃疡面，有较多炎症细胞浸润，腺体排列尚规则，有毛细血管充血。见图3。与模型组比较，美沙拉嗪组、芍药汤组大鼠结肠组织形态学评分明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，表明美沙拉嗪组、芍药汤组大鼠结肠病理变化较模型组改善，而美沙拉嗪组与芍药汤组大鼠结肠形态学评分比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

注：A.空白对照组；B.模型组；C.美沙拉嗪组；D.芍药汤组

图3光镜下各组大鼠结肠组织形态学变化比较(HE染色，10×40倍)

3.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-4、ET水平比较 与空白对照组比较，模型组大鼠血清IL-4、ET、TNF-α水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，芍药汤组和美沙拉嗪组大鼠血清IL-4、ET、TNF-α水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与美沙拉嗪组比较，芍药汤组大鼠血清IL-4、ET、TNF-α水平无明显变化(P>0.05)。见表1。

注：A.空白对照组(n=8)；B.模型组(n=7)；C.美沙拉嗪组(n=10)；D.芍药汤组(n=11)；与模型组比较，*P<0.05

图4 各组大鼠结肠组织形态学评分比较表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-4、ET水平比较

注：与模型组比较，*P<0.05

3.4 透射电镜下各组大鼠结肠黏膜紧密连接变化比较 电镜下空白对照组大鼠结肠组织紧密连接形态完整、连续，无明显扩张及染色增强现象。模型组大鼠结肠组织紧密连接形态尚完整连续，但有明显扩张增宽现象，周围可见大量染色带包裹。美沙拉嗪组及芍药汤组大鼠结肠组织紧密连接形态尚完整连续，扩张增宽现象较模型组轻，周围有少量染色带。结果表明模型组较空白对照组紧密连接明显破坏，与UC模型大鼠的临床表现相符。与模型组比较，美沙拉嗪组、芍药汤组大鼠结肠组织紧密连接形态破坏情况明显减轻。见图5。

4 讨论

炎症反应与黏膜屏障损伤是UC病程中的重要病理变化[6-8]。IL-4是机体中关键免疫调节细胞因子之一，其失调可能导致一系列炎症疾病状态，包括UC[9]。IL-4是关键的Th2细胞因子，并且用于指导免疫应答，在活动期UC中，IL-4能在大量浸润单核细胞的损伤部位聚集。TNF-α是一种加速炎症发展并促成炎症肠病发病的细胞因子[10]，IL-4、TNF-α可能导致患者肠上皮单层细胞受损，上皮细胞缺失，杯状细胞耗竭，炎症细胞浸润，水肿形成，出血和血管扩张[11]。肠黏膜表面上皮细胞形成的选择性渗透屏障具有营养物质交换和宿主防御功能。这些功能依赖于完整的肠上皮细胞层，这些细胞层由细胞侧膜上的细胞-细胞附着物通过紧密连接和附近的粘附连接构成[12]。紧密连接具有选择性地允许某些离子物质的细胞旁转运的能力，可特异性调节细胞旁通透性、细胞旁屏障功能，从而限制细胞旁扩散过程及调节细胞旁通道功能[13]。因此，当UC发生时，机体炎症反应释放大量炎症因子，损伤肠上皮细胞紧密连接，破坏肠黏膜机械屏障，ET经破损的肠黏膜进入机体，二次损伤肠黏膜，从而加重临床症状。目前国际上UC管理指南中已公认美沙拉嗪为治疗UC的临床一线用药[14]。研究发现，美沙拉嗪能够恢复肠道炎症期间在TNF-α诱导下出现的E-钙黏蛋白膜表达的丧失。且美沙拉嗪可以阻止TNF-α对p38MAPK途径的下调作用，有效激活p38MAPK途径，通过调节应激反应途径恢复黏膜肠上皮细胞屏障功能稳态。紧密连接在维持肠黏膜上皮屏障功能稳态中起关键作用，而将紧密连接蛋白募集到顶侧膜是关闭细胞间隙的关键步骤。然而，紧密连接的合成在很大程度上依赖于黏附连接(如E-钙黏蛋白)形成[15]。美沙拉嗪能通过干扰素-γ恢复E-钙黏蛋白和β连环蛋白的膜定位促进紧密连接的合成与募集，从而降低屏障通透性[16]。

注：放大3 000倍时，标尺示2 μm；放大8 000倍时，标尺示1 μm，箭头示结肠黏膜紧密连接

中医认为，UC病机属脾失健运，湿热蕴结肠腑、气滞血瘀。治宜清热燥湿、调和气血为主。芍药汤中黄芩、黄连性味苦寒，入大肠经，可清热燥湿、解毒泻火，以祛除病因，二药共为君药；白芍养血和营、缓急止痛，当归养血活血，木香、槟榔行气导滞，四药相配，调气和血，共为臣药；大黄苦寒沉降，泻热通便，以少量肉桂防苦寒伤中，二药共为佐药；甘草调和诸药，与芍药相配可缓急止痛，为佐使。诸药合用，清热燥湿解毒、调气和血，下痢可愈。

本研究表明，美沙拉嗪、芍药汤均能明显降低UC大鼠结肠组织的DAI评分和血清IL-4、TNF-α、ET含量，减轻UC模型大鼠结肠组织紧密连接结构损伤，且两者的作用相当。

综上所述，芍药汤可能是通过减少血清TNF-α、IL-4、ET含量，修复肠上皮组织紧密连接，减轻炎症反应，保护肠黏膜机械屏障而发挥治疗UC的作用。