张书婉,吴 爽,黄君华,曹三成

(1西安市儿童医院检验科,西安 710003;2西安医学院医学技术学院;*通讯作者,E-mail:shuwan0103@163.com)

肺炎支原体肺炎(Mycoplasmapneumoniaepneumonia,MPP)是儿童最常见的呼吸道感染性疾病[1],占儿童社区获得性肺炎的20%左右[2]。肺炎支原体(MP)感染常会导致儿童凝血功能紊乱[3]和中枢神经系统症状[4],是5岁以下儿童死亡的首位病因。另外,由于诊断不明确的MPP而增加经验性用药,导致大环内酯类抗菌药物的耐药菌株居高不下[5]。MP感染人体后症状不典型,部分患儿无明显临床症状,给早期诊断带来困难。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification assay,LAMP)是一种恒温扩增技术,不需要特殊PCR设备且结果可视化,成本低廉,检测时间短,适合床旁检测,应用呼吸道标本患儿接受性高。近年来LAMP逐渐应用于儿童MPP检测,但不同的研究对LAMP诊断准确性的报道有较大差异[6-9]。本研究通过对LAMP诊断MPP的价值进行Meta分析,旨在探讨LAMP的诊断准确性,为其进一步推广应用提供依据。

1 方法

1.1 文献检索

由两位人员(张书婉、吴爽)独立在PubMed、Embase、Cochrane Library等英文文献数据库和中国知网、万方等中文文献数据库进行文献检索及确定。文献出版日期截止2018年11月27日。检索词为:英文文献数据库应用“LAMP”“loop-mediated isothermal amplification assay”“Mycoplasmapneumoniae”“MP”“Mycoplasmapneumoniaepneumonia”“MPP”等检索词;中文文献数据库应用“LAMP”“环介导等温扩增”“肺炎支原体”“肺炎支原体肺炎”等检索词。

1.2 文献纳入与排除标准

符合以下条件的文献被纳入本研究:评价了LAMP诊断MPP的价值;有明确的参考标准;通过文中数据可直接得到或计算出真阳性(TP)、假阳性(FP)、假阴性(FN)和真阴性(TN)例数;儿童人群。文献纳入由两位人员(张书婉、吴爽)根据标准独立完成,不一致者由二人共同商讨决定。

1.3 数据提取与文献质量评价

由两位人员(张书婉、吴爽)独立提取相关信息及数据并由第三位人员(黄君华)对提取结果进行检查,不一致处由三人共同商讨决定。所提取信息主要包括:第一作者、出版年代、国家、纳入人群疾病类型、研究设计、标本类型、参考方法、LAMP方法及2×2列表数据。

每篇纳入文献的质量应用“诊断准确性研究质量评价(QUADAS-2)[10]”进行评价。主要评价“病例选择”“待评价试验”“参照标准”和“失访、参照标准与待评价试验的间隔时间”等4个方面。每个方面用“yes”“no”或“unclear”回答标志性的问题进行评价,发表偏倚用“low”“high”或“unclear”表示。对前3个方面还用“low”“high”或“unclear”评价其临床适用性。

1.4 统计学处理

应用随机效应模型进行Meta分析。所纳入的每一个研究都计算了敏感度、特异度、阳性似然比(PLR)、阴性似然比(NLR)和诊断比值比(DOR)及其95%可信区间(95%CI)。用综合受试者工作特征曲线(SROC)及曲线下面积(AUC)评价LAMP的综合表现。用Meta回归分析探讨异质性的来源,P<0.05或I2>50%表明差异有统计学意义。用Deek’s法检测发表偏倚。所有的统计学分析由Stata/SE 15.0软件完成。

2 结果

2.1 文献检索结果

通过数据库检索共纳入417篇文献。其中通过Endnote X6排除重复检索301篇;按照纳入和排除标准,通过阅读文章题目和摘要排除96篇,通过阅读全文排除13篇;最终纳入7篇文献[6-9,11-13]。其中一篇文献分别应用两种不同的标本对LAMP进行评价,因此共有8组数据纳入Meta分析。文献筛选过程见图1。

图1 本Meta分析中符合纳入标准的文章筛选流程图Figure 1 Flow chart of selection progress for eligible studies of the meta-analysis

2.2 纳入文献的特征及质量评价

Meta分析纳入的7篇文献为2012-2018年出版,来自中国和日本。共纳入样本1 377例,其中急性社区获得性下呼吸道感染(ACA-LRTI)患儿249例(2篇文献)[8,11],社区获得性肺炎(CAP)1 065例(4篇文献)[6,9,12,13],一篇文献纳入患儿(63例)的疾病情况不明[7]。另外,Kakuya等[8]的研究纳入58例ACA-LRTI儿童分别用口咽拭子和鼻咽拭子两种采样标本检验LAMP的诊断准确性,本研究将两种方法均纳入分析,因此共有8组数据。纳入文献的主要特征见表1。

表1 环介导等温扩增技术诊断儿童肺炎支原体肺炎准确性的meta分析纳入文献的基本特征

Table 1 Characteristics of the study included in the Meta-analysis of LAMP forMycoplasmapneumoniaepneumonia in children

文献及出版年份国家纳入对象疾病种类研究类型 标本类型 LAMP方法 参照方法TPFPFNTNGotoh等,2012[13]日本CAP前瞻性研究 咽拭子In-house血清学方法2998322Gotoh等,2013[12]日本CAP前瞻性研究 咽拭子In-house血清学方法2352313260李丹等,2014[6]中国CAP回顾性研究 咽拭子In-houseQPCR351118Kakuya等,2014[11]日本ACA-LRTI前瞻性研究 咽拭子In-house培养3001160Aizawa等,2014[9]日本CAP前瞻性研究 咽拭子试剂盒(日本荣研化学)血清学方法4302 66Kakuya等(a),2017[8]日本ACA-LRTI前瞻性研究 口咽拭子试剂盒(日本荣研化学)QPCR1500 43Kakuya等(b),2017[8]日本ACA-LRTI前瞻性研究 鼻咽拭子试剂盒(日本荣研化学)QPCR 807 43Wang等,2018[7]中国未知回顾性研究 口咽拭子(45例)支气管肺泡灌洗液(18例)In-houseQPCR3201 30

CAP:community-acquired pneumonia,社区获得性肺炎;ACA-LRTI:acute community-acquired lower respiratory tract infections,急性社区获得性下呼吸道感染;QPCR:荧光定量聚合酶链反应;In-house:实验室内部设计的LAMP方法,非商品化试剂盒;TP:真阳性例数;FP:假阳性例数;FN:假阴性例数;TN:真阴性例数。文献[8]对同一患儿分别用口咽拭子和鼻咽拭子两种标本检验LAMP的诊断准确性,因此将两种方法分别纳入

根据QUADAS-2量表,4篇(50%)文献“病例选择”偏倚为低风险;3篇(37.5%)文献“参照标准”偏倚为“unclear”;“待评价试验”(index test)和“失访、参照标准与待评价试验的间隔时间”(flow and timing)偏倚方面所纳入文献均为低风险。临床适用性(applicability concerns)方面,“patient selection”“index test”和“reference standard”低偏倚文献所占比例较大,分别为87.5%,100%和62.5%(见图2),说明本研究所纳入的文献总体质量较佳。

图2 纳入文献的偏倚风险和临床适用性情况百分条图Figure 2 Risk of bias and percentage bar graph of applicability concern of enrolled references

每篇纳入文献偏倚风险和临床适用性的具体情况见图3。根据QUADAS-2的标准,Wang等[7]的研究所纳入患儿的疾病类型不明,对判断LAMP诊断准确性可能存在高偏倚;Kakuya等[8,11]的两篇论文所纳入的患儿均为急性社区获得性下呼吸道感染(ACA-LRTI)和非社区获得性肺炎(CAP),因此不清楚是否会对LAMP的综合诊断准确性造成影响。Aizawa等[9]和Gotoh等[12,13]的研究以血清学方法为参考标准,而非培养或PCR方法,不清楚是否会对LAMP的综合诊断准确性造成影响。

2.3 诊断准确性和异质性分析

用随机效应模型进行meta分析发现合并敏感度和特异度分别为0.94(95%CI 0.84-0.98)和0.99(95%CI 0.94-1.00)(见图4),说明LAMP诊断儿童MPP时特异度高于敏感度,更适合作为确诊试验应用于临床实践。PLR、NLR和DOR分别为138.01(95%CI 15.38-1 238.65)、0.06(95%CI 0.02-0.17)和2 200.68(95%CI 181.38-26 701.19)(见图5),表明LAMP结果阳性时患MPP的可能性是不患MPP的138倍,而当结果阴性时患MPP与不患MPP的机会比为6%。DOR远大于1,说明LAMP对MPP有很好的判别效果。SROC显示AUC为0.99(95%CI 0.98-1.00)(见图6),说明LAMP诊断儿童MPP的综合效能很理想。

图3 每篇纳入文献的偏倚风险和临床适用性情况Figure 3 Risk of bias and applicability concern summary of enrolled references

从森林图(图4和图5)可以看到纳入的8组数据存在异质性,因此本研究对纳入人群的疾病类型、研究类型、参照方法和试验方法等方面进行Meta回归分析,发现上述四方面在特异度上差异有统计学意义(见图7)。

图4 LAMP诊断MPP敏感度和特异度的森林图Figure 4 Forest plot of sensitivity and specificity for the diagnostic accuracy of LAMP

2.4 亚组分析

本研究对文献中纳入人群疾病类型、研究类型、参照方法和试验方法进行亚组分析,发现以社区获得性肺炎(CAP)为研究人群较急性社区获得性下呼吸道感染(ACA-LRTI)人群LAMP的敏感度高但特异性低;回顾性研究的敏感度高于前瞻性研究,二者特异度相近;参考方法方面,以血清学方法为参考标准时LAMP的敏感度和特异度较低;试剂盒检测的敏感度为91%,较in-house低(93%),但特异性高(见表2)。

图5 LAMP诊断MPP阳性似然比、阴性似然比和诊断比值比的森林图Figure 5 Forest plot of positive likelihood ratio, negative likelihood ratio and diagnostic odds ratio for the diagnostic accuracy of LAMP

图6 LAMP诊断儿童MPP的SROC曲线Figure 6 Summary receiver operating characteristic curve of LAMP diagnostic value in children MPP

2.5 发表偏倚

Deek’s检验表明没有统计学证据支持发表偏倚(P=0.21),说明本研究所纳入的文献无潜在的发表偏倚(见图8)。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001图7 疾病类型、研究类型、参照方法及试验方法的Meta回归分析Figure 7 Meta-regression analysis of disease type, study type, reference, and LAMP assay

表2 疾病类型、研究类型、参照方法及试验方法的亚组meta分析结果

Table 2 Summary of subgroup analysis of the included studies by different study characteristics

亚组文献篇数敏感度(95% CI)特异度(95%CI)合并后总结果80.94(0.84-0.98)0.99(0.94-1.00)疾病类型 CAP40.92(0.85-0.96)0.95(0.91-0.98) ACA-LRTI30.87(0.63-0.93)1.00(0.94-1.00)研究类型 前瞻性研究60.92(0.78-0.97)1.00(0.90-1.00) 回顾性研究20.97(0.84-1.00)0.98(0.81-1.00)参考方法 QPCR40.95(0.69-0.99)0.99(0.79-1.00) 血清学方法30.93(0.79-0.95)0.95(0.96-0.98) 培养法10.97(0.83-1.00)1.00(0.98-1.00)试验方法 In-house40.93(0.85-0.97)0.95(0.91-0.97) 试剂盒40.91(0.68-0.95)1.00(0.94-1.00)

图8 评价纳入文献发表偏倚的漏斗图Figure 8 Funnel graph for the assessment of potential publication bias of included studies

3 讨论

LAMP是一种恒温核酸扩增技术,由于其具有检测时间短,结果可视化,无需特殊仪器等优点,已被广泛应用于病原体的检测[14]。肺炎支原体(MP)是引起儿童社区获得性肺炎的主要病原菌之一,该病原体无细胞壁,难以培养,仅对大环内酯类抗菌药物敏感,且近年来耐药趋势逐渐上升,因此对MP的快速准确诊断尤为重要。LAMP技术以其自身的优点被人们越来越多地应用于诊断肺炎支原体肺炎(MPP)及其他感染性疾病,已有文献[15-18]对LAMP检测其他病原体(如结核分枝杆菌、艰难梭菌等)的诊断准确性进行了Meta分析,但至今没有相关报道对LAMP诊断儿童MPP准确性进行系统综述,因此本研究应用Meta分析来评价LAMP诊断儿童MPP的准确性。

本研究结果显示LAMP诊断儿童肺炎支原体肺炎的合并敏感度和特异度分别为94%和99%,说明其是一种诊断儿童MPP的有效工具;阳性似然比(PLR)为138.01,表明LAMP结果阳性时患MPP的可能性是不患MPP的138倍;阴性似然比(NLR)为0.06,说明LAMP结果阴性时患MPP与不患MPP的机会比为6%;DOR(2 200.68)远大于1,说明LAMP对MPP有很好的判别效果。另外,为阐明LAMP的综合诊断能力,本研究计算了SROC曲线的AUC(为0.99)表明LAMP技术能很好地诊断MPP。Chen等[15]应用Meta分析探讨LAMP检测粪便标本中艰难梭菌的诊断准确性,发现其敏感度、特异度、PLR、NLR、DOR和AUC分别为0.93,0.98,47.72,0.07,745.19和0.98。Nagai等[16]报道LAMP诊断肺结核的合并敏感度、特异度和DOR分别为89.6%,94.0%和145。结合本研究的结果,可以发现LAMP的特异性优于敏感性,说明其对疾病的肯定诊断优于对疾病的筛查。

异质性是干扰Meta分析结果的主要问题,I2显示各研究间存在明显的异质性,因此本研究进一步通过Meta回归试图寻找异质性的来源。通过对纳入人群疾病类型、研究类型、参照方法和试验方法等方面进行Meta回归,发现四方面均会对特异度产生显著的影响,因此对其进行亚组分析。亚组分析可见对CAP患儿和ACA-LRTI患儿,LAMP的敏感度分别为92%和87%,特异度分别为95%和100%;回顾性研究的敏感度(97%)高于前瞻性研究(92%),二者特异度相似(分别为100%和98%);以血清学方法为参考标准时LAMP敏感度和特异度较低(分别为93%和95%),以培养法为参考标准时敏感度和特异度最高(分别为97%和100%),以QPCR为参考标准时敏感度和特异度介于前两者之间(分别为93%和95%);试剂盒和in-house检测的敏感度分别为91%和93%,特异度分别为100%和95%。由此可以推断造成不同研究LAMP敏感度和特异度不同的原因主要有纳入人群疾病类型、研究类型、参照方法和试验方法等。另外,纳入研究的患儿年龄在0.1岁至17岁之间,各个研究均未对具体年龄进行分组,对不同年龄段的患儿LAMP的诊断效能情况无法进行分析,可能是造成异质性的原因之一。有研究[8]表明不同的标本类型对LAMP诊断MPP的准确性有影响,口咽拭子的敏感性高于鼻咽拭子,本Meta分析纳入的研究标本类型多为“咽拭子”,无法区别是“口咽拭子”还是“鼻咽拭子”,因此无法对标本类型进行亚组分析,也可能造成不同研究间的异质性。

本研究虽对LAMP的特性进行了有效地评估,但仍然存在一些问题。首先,纳入的文献多数未交代是否使用盲法,导致“病例选择”和“参照标准”两方面的偏倚风险不明;其次,文献纳入的研究对象不同,目标对象群体MPP的患病率不同也会对合并后的结果造成偏倚;最后,所有研究均来自中国和日本,无法获知种族方面是否存在偏倚。

综上所述,本研究系统地对LAMP诊断儿童MPP的效能进行了Meta分析。尽管存在一些局限性,但当前证据表明LAMP在儿童MPP的诊断中有很高的价值,可有效辅助临床开展对MPP的早期诊断。然而我们仍然需要更多高质量的前瞻性研究诊断试验研究证据对LAMP进行更加科学和全面的评价。