刘 飞,吴甜甜,张千千,郭青玉

(西安交通大学口腔医学院陕西省牙颌疾病临床研究中心,西安 710004;*通讯作者,E-mail:guoqinyu@mail.xjtu.edu.cn)

氟化物广泛存在于自然界的水、空气、岩石和土壤中,也被添加至牙膏、漱口水中,过量摄入氟化物会对机体产生毒性[1]。急性氟中毒最常见的症状有胃肠道反应,包括胃痛、恶心、呕吐、胃肠道出血以及肌肉痉挛等。慢性氟中毒多表现为氟斑牙(dental fluorosis)、氟骨症(skeletal fluorosis)以及一些非骨相器官的损伤[2]。在高氟饮水地区居住10年以上的居民多患有氟斑牙;每天饮水摄氟量超过0.2 mg/kg,氟化物沉积于骨组织,形成氟骨症,导致骨骼脆性增加、强度下降。

饮水中的氟化物是人和动物摄入氟最普遍的方式,占摄入总氟量的60%。饮水中的氟更容易被机体吸收,经口摄入的氟化物被胃肠吸收的吸收率约为80%-97%。流行病学调查显示,在高氟饮水区生活超过20年的居民出现背部疼痛、关节炎及膝部疼痛等。Namkaew等[3]对泰国清迈省的Poo-kha和On-tai两个地区的饮用水含氟浓度与居民慢性疼痛症状之间的剂量-反应关系的回顾性研究发现,534名年龄大于50岁的当地居民存在慢性疼痛,尤其是腰背部的疼痛,与每日饮用水中的含氟量存在明显的相关性。此外,使用氟化物治疗骨质疏松患者时,会出现显著的下肢疼痛副反应[4,5]。

本研究给予幼年小鼠高浓度的氟化物饮水,模拟自然条件下含氟饮水地区的生活环境,在成年后测量小鼠的基础痛阈,为阐明氟化物所致疼痛症状的机制提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

录像追踪系统(SMART,Panlab SL,Barcelona,Spain);Von Frey纤维丝(North Coast Medical Inc,Morgan Hill,USA);热板仪(RB-200,成都泰盟科技有限公司);氟化钠(分析纯,天津市恒兴化学试剂制药有限公司);甲醛溶液(分析纯,南京化学试剂有限公司)。

1.2 实验动物

4周龄雄性C57/BL小鼠24只,体质量(14±2)g,由西安交通大学医学院动物中心提供(SPF级,动物合格证编号为SCXK(陕2012-003))。小鼠被随机分为对照组和实验组,每组12只。饲养室温(22±1)℃;日光灯采光,光暗周期12 ∶12;每4只在同笼饲养,自由采食和饮水,每周更换消毒垫料1次。

1.3 饮用水加氟处理

除小鼠的饮水外,其余饲养条件均完全一致。按饮用水中是否添加氟化物将小鼠分为:对照组,饮用蒸馏水;实验组,饮用100 mg/L的氟化钠溶液。饮水加氟的时间持续于整个实验周期,即鼠龄4-10周,共计6周。

1.4 一般状况及体质量

在小鼠4周龄至10周龄之间,每周周末称取并记录各组小鼠的体质量,同时观察各组小鼠的牙齿、皮毛、精神状态和反应灵敏度等体征。

1.5 旷场实验(open field test,OFT)

将小鼠置于45 cm×45 cm×45 cm的旷场测试箱中,使用录像追踪系统(SMART,Panlab SL,Barcelona,Spain)记录小鼠在实验开始后的前10 min及总60 min内的运动路程。

1.6 Von Frey纤维丝实验

由小鼠4周龄起,每周使用Von Frey纤维丝(North Coast Medical Inc,Morgan Hill,USA)测试其机械痛阈直至鼠龄8周,共5次。11根Von Frey纤维丝对应的机械力值依次为0.008,0.02,0.04,0.070,0.16,0.40,0.60,1.0,1.4,2.0,4.0 g。安静环境下,将小鼠置于半透明有机玻璃笼中,限制其过度活动。金属网格底板小孔每边长约1 mm。测试前先让小鼠适应环境30 min,室温控制在(20±2)℃。测试根据文献[12,13]的方法进行:由0.008 g纤维丝开始依次对小鼠左后爪中心处施加压力至纤维丝呈C型,当小鼠出现缩爪或甩爪时为阳性反应,每根纤维丝施力每次2 s,间隔15 s,共10次。记录首次出现≥2次阳性反应的力值作为疼痛阈值;按公式相对缩爪频率=10次施力中总阳性反应次数/10×100%,计算相对缩爪频率。

祖屋占地面积将近一亩，有主人房、客厅、偏房、豆豉作坊和晒坪。每天早上豆豉作坊弥漫柴火引燃前呛鼻的烟味，柴火引燃后散发出一阵阵木头、树脂、树皮混燃的清香。金黄滚圆的黄豆蒸熟后，整个祖屋都充盈着香甜的黄豆味，经过数道工序，豆子们变成了一颗颗黑黝黝的豆豉。小时候，我最期盼和喜爱的一道菜就是豆豉焖排骨，开胃下饭又回味无穷。

1.7 热板实验(hot plate test,HPT)

鼠龄9周时进行HPT,实验前5 min将热板仪器(RB-200智能热板仪,成都泰盟科技有限公司)预热至设定温度,控制室温为(20±2)℃。将小鼠置于热板上的玻璃罩内密切观察小鼠的活动。一般情况下,大多数小鼠在热刺激下出现不安状况,如举前肢、抬后肢、跳跃、舔咬后爪等,记录小鼠首次跳跃或舔咬后爪出现的时间作为痛阈的指标,称为潜伏期。连续测试3 d,每天3次取平均值;实验前热板仪器选择不同的预设温度,依次为(46±1)℃,(50±1)℃,(54±1)℃;为避免小鼠烫伤,设定保护时间为30 s,若30 s内小鼠未出现疼痛反应,则停止实验并以30 s记录为其潜伏期。

1.8 福尔马林实验(formalin test,FT)

鼠龄10周时进行FT,实验开始前将小鼠放入30 cm×15 cm×15 cm的透明有机塑料玻璃测试盒框中适应30 min。实验时,于小鼠右后爪皮下注射5%的福尔马林溶液50 μl,迅速将小鼠放入测试盒框中,呈45°角放置一块镜子于测试箱后以便观察者更好地观测小鼠的行为。60 min内,每10 min由两名不知情人员观察并记录小鼠的舔咬爪时间及甩爪次数,取平均值用于统计[14]。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 一般状况及体质量

在整个饲养过程中,蒸馏水对照组小鼠活动正常,毛色光亮;实验组小鼠在给氟前期(4-6周龄)精神和行为均未见异常,进食和饮水正常,体毛柔顺;自小鼠8周龄时观察到给氟组小鼠常蜷缩少动,皮毛略皱缩,部分小鼠切牙出现氟斑牙症状,呈淡黄色斑块状。两组小鼠饲养前体质量组间均衡性好,给氟饲养后,体质量增长无统计学差异(P>0.05,见图1)。

图1 长期高氟饮水对小鼠体质量的影响Figure 1 Effect of long-term high fluoride in drinking water on body weight of mice

2.2 长期高氟饮水对小鼠旷场实验中运动距离的影响

在旷场实验中,前10 min及总60 min内的总运动路程两组小鼠无统计学差异(见图2)。

2.3 长期高氟饮水对小鼠机械刺激痛的影响

在Von Frey纤维丝实验中对鼠龄4-8周中疼痛阈值的监测可见,对照组小鼠的痛阈未发生明显变化,曲线平缓;实验组小鼠痛阈呈下降趋势。在鼠龄7周和8周时,实验组小鼠痛阈显著低于对照组小鼠,且两组小鼠的痛阈整体比较有统计学差异(P<0.001,见图3A)。

在Von Frey纤维丝实验中对小鼠4-8周相对缩爪频率的监测可见,在鼠龄4周时两组小鼠的相对缩爪频率并无差异(见图3B);5-6周时实验组小鼠的相对缩爪频率整体高于对照小鼠(见图3C-D);7-8周时实验组小鼠在多个纤维丝对应的力值处相对缩爪频率高于对照组小鼠,并表现出整体上的差异(见图3E-F)。

A.实验开始后前10 min运动距离 B.实验总60 min内运动距离图2 长期高氟饮水对小鼠旷场实验中运动距离的影响Figure 2 Effect of long-term high fluoride in drinking water on distance of exercise in open field test

实验组与对照组相比疼痛阈值(P<0.001)，5周(P<0.05)、6周(P<0.05)、7周(P<0.01)、8周(P<0.001)相对缩爪频率整体均数差异有统计学意义;与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001图3 长期高氟饮水对小鼠机械刺激痛的影响Figure 3 Effect of long-term high fluoride in drinking water on mechanical pain of mice

2.4 长期高氟饮水对小鼠热刺激痛的影响

在HPT中,两组小鼠均可观察到温度依赖的潜伏期缩短现象,且在第1天及第3天(热板温度分别为46 ℃和54 ℃时),两组小鼠的疼痛反应潜伏期均未见统计学差异;在HPT第2天(热板温度为50 ℃)时,实验组小鼠疼痛反应潜伏期明显短于对照组小鼠(P<0.05,见图4)。

2.5 长期高氟饮水对小鼠炎性刺激痛的影响

在1 h的观察期内,实验组小鼠甩爪次数整体多于对照组小鼠;在早时相(0-10 min)和晚时相(20-60 min),以及40 min,50 min,60 min三个时点,实验组小鼠甩爪次数均多于对照组小鼠,具有统计学意义(P<0.05,见图5)。

在1 h的观察期内,两组小鼠的舔咬爪时间整体比较未见统计学差异;在早时相(0-10 min)内实验组小鼠的舔咬爪时间显著长于对照组小鼠,而晚时相(20-60 min)内两组小鼠舔咬爪时间无统计学差异(见图5)。

与对照组相比,*P<0.05图4 长期高氟饮水对小鼠热刺激痛的影响Figure 4 Effect of long-term high fluoride in drinking water on thermal pain of mice

实验组与对照组相比甩爪次数整体差异有统计学意义(P<0.001);与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001图5 长期高氟饮水对小鼠炎性刺激痛的影响Figure 5 Effect of long-term high fluoride in drinking water on inflammation pain of mice

3 讨论

本研究通过给予4周龄小鼠氟化钠饮水,在饲养过程中监测体质量变化并进行多次Von Frey hair实验,在小鼠成年后进行OFT、HPT及FT,结果表明长期高氟饮水环境会导致小鼠成年后对急性机械刺激痛、急性热刺激痛以及慢性炎性疼痛的敏感性显著增加。

本研究观察到两组小鼠体质量均呈正常增长,各组间差异无统计学意义,与Chioca等[6]的结果一致。也有学者观察到给氟组动物体质量增长缓慢的同时,摄食、摄水量下降,据此推测可能是由于饮食摄入量下降影响动物体质量增长[15]。但是在本研究中,限于条件,我们没能精确计算动物的摄食量,只观察到两组小鼠的体质量在各个观察点无统计学差异,因此NaF对动物体质量的影响仍需进一步研究。

OFT可以用于检测小鼠的自发活动[16],本实验中两组小鼠在实验开始后的前10 min内以及总60 min中的总运动路程均无显著性差异,表明含氟饮水并未对小鼠运动能力产生影响。

有研究表明,氟化物可破坏动物的运动系统而降低小鼠的运动功能,原因可能为氟离子置换骨骼中羟基磷灰石的羟基,形成氟磷灰石,造成骨骼发育异常;也可能是由于氟化物抑制了与能量产生、传导有关的酶活性,从而使肌肉功能受损所致[17]。伤害感受行为的测试大多是基于观察动物对痛刺激的逃避行为,因而动物的基础运动能力的改变会显著影响实验结果,如在动物运动能力丧失或降低的情况下得到伤害感受行为改变的实验结果很有可能是假阳性。本实验中首先排除了两组小鼠一般生长发育情况及运动能力的异常,这为其他伤害感受性行为的可靠性提供了保证。

Von Frey纤维丝实验和HPT均用于构建动物的急性疼痛模型,前者为急性机械刺激痛模型[18],后者为急性热刺激痛模型[19]。这些测试通常采用逃避行为/回缩反射或者发声作为疼痛指标。在这些模型中,动物的行为反应导致伤害刺激的终止。在本实验中,给予幼年小鼠含氟饮水一段时间后,实验组小鼠的急性机械痛阈逐渐低于对照组小鼠。在HPT中,两组小鼠均出现温度依赖的潜伏期缩短,在温度为46 ℃时实验组小鼠疼痛反应潜伏期呈现出低于对照组小鼠的趋势,但差异无统计学意义;在温度为50 ℃时实验组小鼠疼痛反应潜伏期显著低于对照组小鼠;温度为54 ℃时三组之间的疼痛潜伏期差异消失。该现象可能是由于温度过高时(54 ℃)热刺激过于强烈,各组小鼠均表现为快速的跳跃或舔咬后爪作为逃避反应,从而消除了组间差异。

FT是目前国内外进行炎性痛研究中经典的动物实验模型。它是通过向动物后爪皮下注射少量伤害性化学刺激物(甲醛溶液),记录动物在化学刺激物作用下对被伤害脚爪的舔咬(licking and biting)以及收缩(flinching)行为[20]。该过程一般分三个阶段,第一阶段(早时相)为急性伤害性反应,从注射后立即开始,持续约5-10 min,是由于甲醛主要引起了C类纤维的兴奋,直接刺激了伤害性感受器所致,是短暂的急性痛反应;中间阶段为静息期;第三阶段(晚时相)从注射后20 min开始持续到注射后60 min,这个阶段可观察到动物由于组织的炎性反应产生的痛觉应答。在本实验中,高浓度氟化物饮水小鼠在FT的两个疼痛时相中的反应均较对照组小鼠显著,表现为甩爪次数的增多和舔咬爪时间的增长。

关于氟化物引起疼痛的原因,目前研究较少。Schnitzler等[21]认为这种疼痛症状是骨源性的。他们对5位骨质疏松的患者使用每日1.09 mg/kg氟化物治疗,患者均出现疼痛症状,通过影像学检查发现其存在骨小梁应力性微结构骨折[21]。但是Desmond等[22]对11位骨质疏松患者给与平均78 mg/d氟化钠治疗后出现相似的疼痛症状,对其进行连续的X线观察,仅有5位患者存在应力性微骨折,其余的患者并未表现出明显的骨性损伤,Desmond等[22]由此认为应力性微骨折并不是造成疼痛唯一的原因,而是整个疼痛过程的一个组成部分。此外,还有学者推测过量的氟化物可能抑制胰岛素的生成而导致高血糖,从而导致大鼠的疼痛症状[23]。因此,本实验观察到的含氟饮水引起的小鼠基础痛阈下降的外周和中枢机制尚有待进一步研究。

本研究通过给予小鼠高浓度氟化物饮水,在生长过程中及成年后通过疼痛行为学实验评价,发现饮用水中含高浓度氟化钠(100 mg/L)的小鼠基础痛阈显著降低,对包括急性机械刺激痛、急性热刺激痛以及慢性炎性疼痛的反应更为明显。这一实验结果为探究慢性氟中毒患者疼痛症状出现的原因和机制提供了动物模型。