尹 思,杜 恒*,赵为公,麻少辉,张 明,管 民,刘 淼

(1西安交通大学第一附属医院骨科,西安 710065;2西安交通大学第一附属医院影像科;3河南省人民医院影像科;*通讯作者,E-mail:drdu168@126.com)

椎间盘是人体内最大的无血供组织,椎间盘的营养通路主要有两种方式:一是终板营养途径,椎体内血管的营养物质通过骨髓腔-血窦-软骨终板扩散到椎间盘,营养髓核及纤维环内层,此途径是椎间盘营养的主要途径[1];二是纤维环营养途径,营养物质从纤维环表面的血管扩散进入纤维环外层,营养范围相对较局限[2]。大量研究证实椎间盘营养障碍会导致椎间盘退变的发生,影响椎间盘营养的因素主要有椎体的血液供应和软骨终板的生理状态等[3,4]。

动态增强MRI(DCE-MRI)是近年来被广泛采用研究终板营养途径的弥散过程,进而反映椎间盘的营养机制的重要技术,它是通过测量顺磁性对比剂进入椎间盘的快慢及多少定量观察椎间盘的强化程度,可以直观反映椎间盘的营养物质通过椎体、软骨终板及髓核组织的整个弥散过程,具有无创、可重复、可定量分析等优点[5-7]。本实验通过对正常活体成年山羊腰椎进行DCE-MRI研究,选用不同类型的对比剂定量观察研究山羊腰椎椎体、软骨终板和髓核组织的弥散途径和特性,为椎间盘营养途径和机制的深入研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 伦理学声明

动物实验已被西安交通大学第一附属医院伦理委员会批准实施,审查批件号:2015伦审科字第G-8号,并遵守相关实验动物饲养与使用指南。实验过程中遵守实验动物伦理原则,尽可能减少实验动物的痛苦,并妥善处理动物尸体。

1.2 实验动物

选取来自同一畜牧区相同品种的成年雌性山羊8只,24月龄,体质量为35-45 kg,平均(41.1±5.8)kg,由西安交通大学医学院动物中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(陕)2007-001。经检验检疫合格,无任何畜类疾病及传染病,标准饲养条件下适应性饲养2周。

1.3 主要试剂与仪器

硫酸阿托品注射液(2 ml ∶1 mg，天津药业集团新郑股份有限公司)；地西泮注射液(2 ml ∶10 mg，上海旭东海普药业有限公司)；速眠新Ⅱ注射液(1.5 ml ∶0.2 g，军需大学兽医研究所)；丙泊酚注射液(200 mg，北京费森尤斯卡比医药有限公司)；钆贝葡胺(Gd-BOPTA)注射液(相对分子量1 058.17，离子型；5.290 g，Bracco S.P.A,意大利)；钆双胺(Gd-DTPA-B)注射液(相对分子量573.66，非离子型；5.74 g，GE Healthcare，爱尔兰)。1.5T双梯度磁共振系统(Intera Achieva，Philips公司，荷兰)。

1.4 DCE-MRI扫描

实验前山羊禁饮食24 h,术前30 min肌注阿托品0.05 mg/kg和地西洋10 mg。实验开始时山羊肌肉注射速眠新Ⅱ(0.3 ml/kg)。选择耳缘静脉安置静脉留置针,滴注丙泊酚注射液(2 mg/kg)维持镇定,滴速根据山羊麻醉深度调整。

将山羊置于侧卧位,用鱼肝油体表定位,分别标记腰1、腰6椎体棘突。在腰椎背侧放置装有纯净水的50 ml注射器作为水模。采用SENSE相共振体线圈包裹羊腰椎,侧卧位,先行T2WI-TSE-SPAIR扫描(TR/TE=3 500 ms/60 ms,层厚/层间距=4.0 mm/0.6 mm,扫描时间为211 s)。然后进行矢状位T1-TSE-SPIR平扫(TR/TE=400 ms/7.8 ms,层厚/层间距=4.0 mm/0.6 mm)。

1.5 钆贝葡胺DCE-MRI扫描

常规扫描之后行DCE-MRI扫描,经耳缘静脉留置针快速推注钆贝葡胺,剂量为0.3 mmol/kg,推注完后以20 ml生理盐水冲管。以推注完对比剂时刻作为0 min,分别于0 min,5 min,10 min,30 min,1 h,1.5 h,2 h,2.5 h扫描,序列为矢状位T1-TSE-SPIR,参数与平扫时完全相同。全部试验用时5-7 h。扫描结束后拔出气管插管,经静脉留置针静滴生理盐水100 ml,约5 min后山羊清醒。

1.6 钆双胺DCE-MRI扫描

将参加上述实验的山羊饲养1周后,行钆双胺DCE-MRI扫描,具体步骤同上。扫描结束后拔出气管插管,经静脉留置针静滴生理盐水100 ml,术后观察直至山羊清醒。

1.7 DCE-MRI图像处理

扫描结束后选取腰椎正中矢状位层面进行ROI测量。感兴趣区(region of interest,ROI)分别选取相应椎间隙上下椎体中心区域、上下软骨终板区、髓核共5个区域。按照观察部位形态,椎体和终板区ROI选取矩形,像素数目分别为80和12个;髓核区ROI选取椭圆形,像素数目为16个。在水模区选取矩形ROI,像素数目为100个。选取ROI时避免容积效应影响。在相同的窗宽窗位下分别测量不同时间点扫描野内显示清晰的分布在椎体、软骨终板和髓核的5个ROI信号强度值(见图1)。绘制椎体、软骨终板区及髓核时间-信号强度曲线。

测量要求:测量各ROI在增强前、增强后0 min,5 min,10 min,30 min,1 h,1.5 h,2 h,2.5 h的信号强度值。增强前后不同时间点观察图像均选择正中矢状层面;测量时保证窗宽窗位相同;每次将ROI置于相同的位置;如遇ROI确定有困难,可与其他序列对比校正。

以平扫时ROI的信号强度(signal intensity,SI)为增强前,增强后某一时间点的信号强度为SI增强后,计算增强率=(SI增强后-SI增强前)/SI增强前×100%,绘制各ROI时间-增强率曲线。

椎体区ROI为大面积矩形;软骨终板区ROI为小面积矩形;髓核区ROI为椭圆形图1 山羊椎体、终板及髓核ROI选择示意图Figure 2 The selection of ROI in the vertebrae, cartilage endplate and nucleus pulpous of the goats

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 山羊腰椎椎体时间-增强率曲线

静注Gd-BOPTA后,山羊腰椎椎体中心区域信号强度从0 min开始迅速上升,至5 min时达到高峰(增强率216.1%±23.3%)后缓慢下降,于1.5 h时(增强率81.0%±7.00%)再次开始逐渐缓慢上升直至2.5 h。而静注Gd-DTPA-B后,山羊腰椎椎体中心区域信号强度也从0 min开始迅速上升,上升幅度较Gd-BOPTA低,至5 min时达到高峰(增强率119.1%±6.81%)后缓慢下降,直至2.5 h时趋于平缓(见表1)。两组对比剂在山羊椎体中不同时间点的增强率之间差异均有统计学意义(P<0.01)。两组对比剂在山羊椎体中增强率的最高峰值之间差异有统计学意义(P<0.01)。山羊腰椎椎体时间-增强率曲线见图2。

2.2 山羊软骨终板区时间-增强率曲线

静注Gd-BOPTA后,山羊软骨终板区时间-增强率曲线与椎体时间-增强率曲线趋势大致相同,至5 min时上升至最高峰(增强率168.7%±39.4%),而后下降趋势较为平缓。静注Gd-DTPA-B后,软骨终板区信号强度从0 min开始上升,但至10 min时上升至最高峰(增强率81.6%±16.8%),其最高信号强度较椎体低,而后下降趋势也较为平缓。

表1 两组对比剂在山羊椎间盘不同部位不同时间增强率对比

Table 1 The signal intensities of regions of interest in the vertebrae, cartilage endplate and nucleus pulposus at different time points with two contrast agents

部位-对比剂0 min 5 min 10 min 30 min 60 min 90 min 120 min 150 min椎体 Gd-BOPTA0 216.1±23.3183.8±17.8156.2±18.7126.6±14.881.0±7.00 83.7±5.9690.2±7.88 Gd-DTPA-B0 119.1±6.81∗∗116.2±6.97∗∗ 85.2±9.52∗∗ 72.0±6.88∗∗52.8±7.77∗∗ 47.7±6.39∗∗43.9±7.24∗∗软骨终板 Gd-BOPTA0 168.7±39.4153.6±32.4135.4±27.2 93.3±20.783.0±23.1111.8±29.195.4±19.9 Gd-DTPA-B0 68.6±19.2∗∗ 81.6±16.8∗∗ 67.5±23.2∗∗ 69.4±19.2∗51.1±20.1∗ 50.2±16.0∗∗51.3±13.5∗∗髓核 Gd-BOPTA0 6.03±11.9 8.10±12.3 16.5±17.6 36.5±14.970.5±20.0102.4±21.425.8±15.4 Gd-DTPA-B0-4.42±7.61 6.24±9.67 17.0±7.92 53.7±8.69∗64.6±7.97 73.4±9.80∗∗88.5±7.56∗∗

Gd-BOPTA:钆贝葡胺;Gd-DTPA-B:钆双胺;与Gd-BOPTA组比较,*P<0.05,**P<0.01

与钆双胺组比较,*P<0.05,**P<0.01图2 两组对比剂静注后山羊腰椎椎体时间-增强率曲线Figure 2 The time-signal intensity curves of DCE-MRI with two contrast agents in the vertebrae of the goats

两组对比剂在山羊软骨终板中不同时间点的增强率之间差异均有统计学意义(P<0.05)。两组对比剂在山羊软骨终板中增强率的最高峰值之间差异有统计学意义(P<0.01)。山羊软骨终板区时间-增强率曲线见图3。

2.3 山羊腰椎髓核时间-增强率曲线

静注Gd-BOPTA后,山羊腰椎髓核时间-增强率曲线呈缓慢上升趋势,至2 h时达到最高峰(增强率102.4%±21.4%),其后迅速下降。静注Gd-DTPA-B后,山羊腰椎髓核区域信号强度在5 min内显示为负值,之后缓慢上升,直至2.5 h时达到最高峰(增强率88.5%±7.56%)。两组对比剂在山羊腰椎髓核中的增强率仅在1 h(P<0.05)、2 h(P<0.01)和2.5 h(P<0.01)时差异有统计学意义,在其他时间点时两者差异无统计学意义。两组对比剂在山羊腰椎髓核中增强率的最高峰值之间差异无统计学意义(P=0.11)。山羊髓核区时间-增强率曲线见图4。

与钆双胺组比较,*P<0.05,**P<0.01图4 两组对比剂静注后山羊腰椎髓核区时间-增强率曲线Figure 4 The time-signal intensity curves of DCE-MRI with two contrast agents in the nucleus pulpous of the goats

3 讨论

椎间盘是体内最大的无血管结构,其营养成分主要通过血管进入椎体,再经椎体内部的小血管到达终板区,通过终板弥散进入髓核。因此,当上述环节中的任何一环发生问题时,椎间盘的营养就受到影响[8]。对比剂的终板弥散特性是对比剂自然属性和椎间盘特性共同作用的结果。静脉注射不同性质的对比剂弥散至椎间盘的量,不仅取决于对比剂的剂量、电磁性和分子量等属性,也取决于椎体、终板、髓核的性状[9,10]。本实验选用不同类型的对比剂定量观察软骨终板的弥散特性,进而研究椎间盘的终板营养途径的特性和其在椎间盘物质代谢中的作用。

3.1 对比剂的剂量对终板弥散的影响

目前,对比剂已广泛应用于DCE-MRI检查中,以增加体内不同组织之间的对比性[11,12]。当MRI的信号强度在原有基础上提高25%以上时,才能通过肉眼区分[13]。利用DCE-MRI技术可以无创地定量分析椎间盘的营养弥散运输过程[5-7,14]。多项报道证实利用DCE-MRI分析椎间盘的终板营养途径的过程中,对比剂在到达软骨终板区之前,主要先通过各级血管到达椎体,其椎体区域的时间-增强率曲线主要受到对比剂剂量的影响,即对比剂的剂量越大,椎体区域的强化效果就越明显。Ibrahim等[15]在11只家兔体内注射0.1-2.8 mmol/kg剂量的钆喷酸葡胺并观察腰椎间盘的增强MR的影像,发现只有在对比剂剂量大于0.3 mmol/kg时对比增强的影像才能被检测到。Akansel等[16]通过为18名患者分别注射0.1 mmol/kg和0.3 mmol/kg的钆特醇,检测所有患者的腰椎间盘增强MR的信号强度,证实当对比剂剂量累积达到0.3 mmol/kg时,信号强度要显著高于0.1 mmol/kg剂量组,而且这种信号增强的程度在终板附近比在椎间盘中央区域更为明显。

在本研究中两种对比剂在相同的剂量下(0.3 mmol/kg),椎体区域的时间-增强率曲线峰值的到达时间基本一致,但峰值存在差异。造成这种差异的主要原因是Gd-BOPTA含有苯氧基,属于芳香环类化合物,具有亲脂性,可与血浆蛋白尤其是白蛋白发生可逆性的结合。Gd-BOPTA在人类血浆组织中的纵向弛豫率(r1)和横向弛豫率(r2)分别为9.7,12.5/(mmol/L·s),比传统的细胞外间隙对比剂高出近1倍,其弛豫率为Gd-DTPA的2倍,即一半剂量时即可达到同样的增强效果[17]。因此,在椎体区域的时间-增强率曲线峰值上,Gd-BOPTA的最高峰值要显著高于Gd-DTPA。

3.2 对比剂的电磁性对终板弥散的影响

软骨终板的主要生化组成蛋白多糖是调节椎间盘物质运输的关键因素。蛋白多糖是一类含有多聚负离子的化合物,对水和阳离子具有较大的亲和力。这就意味着阳性和中性的溶质能相对自由地进入椎间盘;而含阴离子的物质则不容易通过椎间盘。譬如葡萄糖、氧气可以相对自由地扩散进入椎间盘;阴离子如硫离子、氯离子等则不容易扩散通过终板。软骨终板的蛋白多糖含量的减少可引起椎间盘的营养运输障碍,导致髓核中蛋白多糖的含量下降,甚至椎间盘退变的发生。而在髓核中央,由于低氧气环境和乳酸浓度高,髓核内的蛋白多糖带有较多的固定负电荷,对中性或阳离子物质具有亲和力,因此中性或阳性离子可以相对容易地通过终板进入椎间盘,而阴离子则不易进入椎间盘[18,19]。

在本研究中,可观察到以下有趣现象:Gd-BOPTA在椎体和软骨终板区的时间增强率的峰值要显著高于Gd-DTPA(约2倍左右),但在髓核中的峰值却与后者非常接近。这恰恰说明软骨终板和髓核基质对于对比剂弥散作用的影响。本研究发现两种对比剂在相同的剂量下椎体、软骨终板和髓核的时间-增强率曲线存在较大差异,其原因主要在于不同对比剂之间电磁性的差异,进而导致通过软骨终板区达到髓核的对比剂的数量不同。

3.3 对比剂的分子量对终板弥散的影响

磁共振增强对比剂分子量的大小也影响了其在椎间盘弥散速度的快慢[9,10]。一般来讲,正常椎间盘中,对比剂的弥散与其分子量成反比。大分子量及半径的物质比小分子量物质弥散更慢。将对比剂链接高分子量的溶质,会抑制其向椎间盘的弥散。Perlewitz等[20]在家兔体内静脉注射相同剂量的钆喷酸葡甲胺盐(相对分子量546)及钆-聚赖氨酸螯合物(相对分子量40 000),并比较两种对比剂在家兔椎间盘内的弥散情况,发现钆-多聚赖氨酸的椎间盘增强值显著小于钆喷酸葡胺,但在肌肉中的含量两者之间却无显著差异。这可能提示溶质的分子量大小影响它们穿透软骨终板基质的能力,分子量越大渗透能力越低,小分子量的营养物质更容易弥散到椎间盘髓核中。本研究的结果也印证了上述观点,Gd-BOPTA的分子量几乎是Gd-DTPA-B的分子量的2倍左右,使得Gd-DTPA虽然在椎体和软骨终板区的增强率的峰值只有Gd-BOPTA的一半左右,但是在髓核中的峰值几乎相同。除了不同对比剂之间电磁性的差异以外,对比剂分子量的大小也是影响溶质通过终板弥散的另一个重要影响因素。

本实验利用不同对比剂通过DCE-MRI技术研究山羊腰椎椎体、软骨终板和髓核弥散的途径及特性,证实了溶质的剂量、电磁性和分子量都是影响终板弥散过程的重要因素,为今后椎间盘营养途径和机制的深入研究奠定了理论基础。