王 斌,张志敏,宋 扬,何 轩,金 丰,王 阁,李 建

(陆军军医大学大坪医院肿瘤中心,重庆 400042;*通讯作者,E-mail:lmno051049@126.com)

膀胱癌是我国泌尿系统中发病率最高的恶性肿瘤,研究膀胱癌细胞关键分子的作用机制,对深入了解膀胱癌的发生、发展过程及分子靶向治疗具有重要的临床意义[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性小分子非编码RNA,可与靶基因mRNA的3′非翻译区(UTR)区结合,促进靶基因mRNA的降解或者导致其沉默,进而抑制靶基因的表达[2]。miRNA在肿瘤特别是膀胱癌的发生、发展过程中具有重要的调控作用,研究miRNA在膀胱癌中的作用机制,对膀胱癌的诊断、治疗及判断预后具有重要的指导意义[3]。miR-8085在疾病中的作用报道研究很少。本研究通过检测miR-8085在膀胱癌组织中的表达及过表达人膀胱癌J82细胞中miR-8085的表达为模型,分析miR-8085在膀胱癌细胞中的作用机制,为膀胱癌的分子诊断标志物和靶向治疗提供一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 组织样本来源

来源于陆军军医大学第三附属医院野战外科研究所肿瘤中心2016-08～2018-02手术切除的32例膀胱癌和癌旁正常组织样本,手术切下的样本迅速冻存于液氮保存,术后病理均证实为膀胱癌。本研究经陆军军医大学第三附属医院伦理委员会批准,患者均签署了知情同意书。

1.2 细胞株和主要试剂

人膀胱癌细胞株J82购于上海信然生物技术有限公司。阴性对照慢病毒、携带miR-8085的慢病毒、miR-NC和miR-8085模拟物购于上海吉玛公司;实时定量聚合酶链反应(qPCR)试剂盒购于日本TaKaRa公司;RPMI-1640培养基购于美国Hyclone公司;胎牛血清购于美国Gibco公司;Transwell小室购于美国Corning公司;双荧光素酶报告基因实验试剂盒购于美国Promega公司;野生型与突变型TOP2A 3′非翻译区荧光素酶报告基因质粒(pGL-4载体)购于南京诺唯赞生物科技有限公司;Lipofectamine®3000和基质胶购于美国Life Technologies公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒购于美国Sigma公司;一抗N-cadherin、TOP2A、GAPDH、CDK4、Twist1及Cyclin B和二抗羊抗兔购于美国Abcam公司;超敏ECL发光试剂盒购于美国Thermo公司。

1.3 细胞培养和感染

人膀胱癌细胞株J82培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。将对数生长期的J82细胞接种于6孔板,待细胞汇合度为60%-70%时,分别感染携带miR-8085的慢病毒和阴性对照慢病毒,命名为实验组和对照组。感染操作依据慢病毒感染说明书严格操作。感染后第8-12小时观察J82细胞状态并更换培养基。

1.4 qPCR检测miR-8085和TOP2A的表达量

应用Trizol法提取组织和细胞中总RNA,并逆转录为cDNA。qPCR试剂盒扩增检测组织和细胞中miR-8085或TOP2A的表达量。qPCR扩增参数:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性15 s,62 ℃退火17 s,72 ℃延伸17 s,共36个循环。qPCR数据采用2-ΔΔCt方法处理。分别以U6和GAPDH作内参,计算miR-8085和TOP2A的表达量。引物序列如下,GAPDH上游引物:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′;miR-8085上游引物:5′-GGGTGGGAGAGAGGACTG-3′,下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;TOP2A上游引物:5′-TGGCTGTGGTATTGTAGAAAGC-3′,下游引物5′-TTGGCATCATCGAGTTTGGGA-3′。

1.5 Transwell侵袭实验检测感染J82细胞的侵袭能力

收集两组感染细胞,使用无血清RPMI-1640培养基调整细胞密度为2.5×105个/ml。基质胶均匀铺在Transwell小室上室,37 ℃凝固30 min。在Tran-swell小室上室加入200 μl/孔细胞悬液,在Transwell小室下室加入650 μl/孔含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,置于培养箱。连续培养1 d,使用多聚甲醛固定18 min,使用结晶紫染液染色18 min,使用流水轻轻冲洗,使用棉签轻轻擦去未穿过底膜的细胞。室温下晾干后,使用显微镜计数穿过底膜的细胞数,每孔随机选4个视野计数,取平均数并统计分析。

1.6 MTT法检测感染J82细胞的增殖能力

收集两组感染细胞,使用培养基调整细胞密度,以每孔3 000个接种于96孔板,加入200 μl/孔培养基。分别于接种后第1,2,3,4,5天检测每孔细胞的吸光度(A)值。每孔加入MTT试剂20 μl,使其终浓度达到5 mg/ml,在培养箱培养4 h;4 h后吸去上清,加入200 μl/孔二甲基亚砜,在摇床充分振荡,促进结晶溶解。采用酶标仪检测波长495 nm处每孔的吸光度(A)值。

1.7 生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验验证miR-8085的靶基因

使用生物信息学预测软件OncomiR、RegRNA2.0、starbase v2.0和PICTAR2预测miR-8085可能的靶基因。TOP2A 3′UTR-MUT为突变型TOP2A 3′非翻译区质粒,TOP2A 3′UTR-WT为野生型TOP2A 3′非翻译区质粒。将对数生长期的J82细胞接种于6孔板,细胞汇合度为40%-60%时,将miR-8085模拟物或miR-NC分别和TOP2A 3′ UTR-WT或TOP2A 3′ UTR-MUT质粒共转染至J82细胞,转染严格依据Lipofectamine®3000说明书操作。采用双荧光素酶报告基因实验试剂盒检测每组J82细胞的萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性,采用“萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性”表示每组J82细胞的相对荧光素酶活性。

1.8 Western blot检测靶基因的表达

收集两组感染细胞并提取总蛋白,每组分别提取30 μg蛋白溶液,在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳1.5 h,电转2 h至PVDF膜,5%脱脂牛奶配成的封闭液封闭3 h。在4 ℃摇床上,分别孵育CDK4(稀释比为1 ∶1 000)、TOP2A(稀释比为1 ∶2 000)、Cyclin B(稀释比为1 ∶3 000)、Twist1(稀释比为1 ∶500)、N-cadherin(稀释比为1 ∶500)和GAPDH一抗(稀释比均为1 ∶1 000)。一抗孵育12 h,加入对应的二抗羊抗兔,室温下孵育2 h。加入超敏ECL发光试剂,应用凝胶成像仪显影、拍照、分析。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 膀胱癌组织中miR-8085的表达

qPCR结果显示,32例膀胱癌组织和癌旁组织中miR-8085的相对表达量分别为2.50±0.78和7.35±0.92,癌旁组织miR-8085的相对表达量是膀胱癌组织的2.94倍,差异有统计学意义(t=12.94,P<0.01,见图1)。

与癌旁组织比较,**P<0.01图1 膀胱癌组织和癌旁组织中miR-8085的相对表达量Figure 1 Expression of miR-8085 in bladder cancer tissue and paracancerous tissue

2.2 J82细胞感染miR-8085病毒的效率

qPCR结果显示,对照组和实验组细胞中miR-8085的相对表达量分别为1.08±0.25和9.69±1.05,实验组miR-8085的相对表达量是对照组的8.97倍,差异有统计学意义(t=7.99,P<0.01,见图2)。

与对照组比较,**P<0.01图2 对照组和实验组J82细胞中miR-8085的相对表达量Figure 2 Expression of miR-8085 in J82 cells in control group and experimental group

2.3 miR-8085对J82细胞侵袭能力的影响

对照组和实验组细胞中穿膜J82细胞数分别为82.63±7.60和35.45±11.27个。与对照组比较,实验组穿膜J82细胞数明显较少,差异有统计学意义(t=3.47,P<0.05,见图3),miR-8085具有抑制膀胱癌J82细胞侵袭的能力。

与对照组相比,*P<0.05图3 miR-8085对J82细胞侵袭能力的影响Figure 3 Effect of miR-8085 on the invasion ability of J82 cells

2.4 miR-8085对J82细胞增殖能力的影响

MTT法结果显示,实验组J82细胞在感染后第3,4,5天的A值低于对照组,差异均有统计学意义(t=2.90,P<0.05;t=4.54,P<0.05;t=5.79,P<0.01),表明miR-8085具有抑制膀胱癌J82细胞增殖的能力。在第1,2天的A值差异无统计学意义(t分别为0.09,1.73,均P>0.05,见图4)。

2.5 生物信息学预测结果

采用生物信息学预测软件miRNAMap、miRDB、RNAhybrid及miRanda分析,miR-8085的靶基因可能是TOP2A,结合区域序列见图5。

与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01图4 miR-8085对J82细胞增殖能力的影响Figure 4 Effect of miR-8085 on the proliferation of J82 cells

图5 miR-8085与TOP2A 3′-UTR结合区域的序列Figure 5 Sequence of the binding region of miR-8085 and TOP2A 3′-UTR

2.6 双荧光素酶报告基因实验验证miR-8085靶向结合TOP2A

TOP2A 3′UTR-WT核心序列为“UCUCCCA”,TOP2A 3′UTR-MUT突变序列为“AGAGGGU”。分别将miR-8085模拟物或miR-NC与TOP2A 3′UTR-MUT或TOP2A 3′UTR-WT共转染至J82细胞中,双荧光素酶报告基因实验检测相对荧光素酶活性。miR-8085与TOP2A 3′UTR-WT共转染可有效降低相对荧光素酶活性(t=12.75,P<0.01),miR-8085与TOP2A 3′UTR-MUT质粒共转染对相对荧光素酶活性无明显作用,表明miR-8085可直接靶向结合TOP2A基因(见图6)。

2.7 J82细胞感染miR-8085慢病毒对TOP2A mRNA表达的影响

qPCR结果显示,感染miR-8085慢病毒后的实验组J82细胞中TOP2A mRNA的相对表达量(0.20±0.03)明显低于对照组(1.01±0.09),差异有统计学意义(t=8.79,P<0.01),表明miR-8085可有效抑制TOP2A mRNA的相对表达。

1.miR-8085+TOP2A 3′UTR-MUT;2.miR-8085+TOP2A 3′UTR-WT;3.miR-NC+TOP2A 3′UTR-MUT;4.miR-NC+TOP2A 3′UTR-WT;与miR-8085+TOP2A 3′UTR-MUT比较,**P<0.01图6 双荧光素酶报告基因实验验证miR-8085靶向结合TOP2AFigure 6 Verification of the binding of miR-8085 to TOP2A by dual luciferase reporter assay

2.8 TOP2A蛋白、侵袭与增殖相关蛋白的表达水平

Western blot结果表明,感染miR-8085慢病毒后的实验组J82细胞中,TOP2A蛋白表达量明显降低,细胞侵袭相关蛋白Twist1蛋白以及N-cadherin蛋白表达明显减少,细胞增殖相关蛋白Cyclin B蛋白以及CDK4蛋白表达减少(见图7)。

图7 miR-8085对TOP2A蛋白及相关蛋白表达的影响Figure 7 Effect of miR-8085 on the expression of TOP2A protein and related proteins

3 讨论

微小RNA(miRNA)由19-25个核苷酸构成,通过在转录后水平调控基因的表达,参与细胞增殖、分化、凋亡、衰老、转移等各种生物学行为[4,5]。越来越多的研究表明,miRNA在膀胱癌的的发生、发展中发挥重要的调控作用,miRNA机制研究已成为膀胱癌研究领域的重点[6,7]。如miR-497[8]、miR-139-5p[9]、miR-608[10]等miRNA在膀胱癌组织中的表达量明显减少,可显著抑制膀胱癌细胞的生长或转移。如miR-556-3p[11]、miR-495[12]在膀胱癌组织中的表达量明显增加,可显著促进膀胱癌细胞转移和增殖。miR-8085是一种新发现的miRNA,关于miR-8085的研究未见报道。miR-8085在膀胱癌中表达情况及其作用机制尚不清楚。

本研究结果显示,miR-8085在膀胱癌组织中的表达显著少于癌旁组织,miR-8085可能参与抑制膀胱癌的生长。为了进一步研究miR-8085对膀胱癌增殖和转移的影响,本研究以载有miR-8085的慢病毒感染膀胱癌J82细胞为研究对象,通过Transwell侵袭实验和MTT法分析过表达miR-8085后,J82细胞侵袭和增殖能力的改变。与阴性对照慢病毒相比,miR-8085慢病毒可显著抑制膀胱癌J82细胞的侵袭能力和增殖能力,miR-8085具有抑制膀胱癌转移和生长的作用。

miRNA主要通过抑制靶基因的表达,参与调控细胞的生物学功能[13]。本研究采用生物信息学预测软件miRNAMap、miRDB、RNAhybrid及miRanda预测发现,miR-8085可能的靶基因拓扑异构酶IIα(TOP2A)。TOP2A参与构成核基质,通过参与DNA的复制、转录、基因重组等过程,影响细胞生物学行为[14]。TOP2A在正常细胞和组织中表达呈低水平状态,前列腺癌、结直肠癌等多种肿瘤组织中表达明显增加,参与肿瘤细胞的分化、增殖、转移及血管生成等[15,16]。TOP2A在肿瘤的增殖和侵袭可能具有明显的促进作用[16]。有研究表明,TOP2A在膀胱癌中的表达明显增加,且与膀胱癌患者的TNM分期和不良预后明显相关[17]。因而,通过抑制TOP2A的表达,可能具有抑制膀胱癌生长和转移的作用。本研究通过双荧光素酶报告基因实验发现,miR-8085可直接靶向结合TOP2A mRNA的3′UTR区域。qPCR和Western blot结果进一步显示,过表达miR-8085在mRNA和蛋白水平上均可抑制TOP2A的表达。降低TOP2A蛋白的表达后,细胞侵袭相关蛋白Twist1和N-cadherin蛋白表达明显降低,细胞增殖相关蛋白Cyclin B和CDK4蛋白表达明显降低,表明细胞侵袭能力和增殖能力受到明显抑制。miR-8085是通过降低TOP2A基因的表达,参与抑制膀胱癌细胞的侵袭和增殖能力。

本研究确定了miR-8085和TOP2A的靶向调控关系,miR-8085可通过靶向抑制TOP2A基因的表达,抑制膀胱癌细胞的侵袭和增殖能力,为进一步研究miR-8085和TOP2A在膀胱癌生长和转移的中的作用奠定了实验基础。