宁庆庆， 亐开兴， 胡应武， 张继才， 黄必志， 陈 宏， 雷初朝*

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.云南省草地动物科学研究院，云南 小哨 650212；3.云南省新平县者竜乡农业综合服务中心，云南 新平 653408)

昭通牛主产于云南省昭通市，分布于全市所辖11个县(区)，属云南省地方优良品种[1-2]。产区分布区域从海拔267 m江边河谷区到海拔3 090 m高寒山区，属亚热带气候类型。1962年在昭通盆地(在距今约100万年前的更新纪地层中)发现原牛化石，表明昭通牛驯化历史久远，并经过当地自然环境和人为的长期选育，形成现在的昭通牛[1]。昭通牛属于役肉兼用型，其特点是性格温顺，行动敏捷，管理性能好；体质坚实匀称，肉质良好，难产率低；耐粗、耐寒、耐旱、耐热、耐湿、适应性强，役用性能好[1]。目前，昭通牛商业用途的广泛化使其引入很多外来牛品种冻精进行杂交改良，导致纯种昭通牛数量急剧减少，如果不加以保护，昭通牛可能在不久的将来处于濒危状态。

Y染色体由雄性特异区(MSY)和拟常染色体区(PAR)组成，其中MSY区作为Y染色体的非重组区，具有父系遗传的特点，且Y染色体单倍体性完整，有较低的突变率并不易受重组和回复突变等因素的影响，故为家牛的起源进化、遗传多样性和群体遗传结构等研究的重要工具[3]。近年来，Y染色体单核苷酸多态性(Y-SNPs)和微卫星(Y-STRs)标记已作为家牛遗传研究的重要依据。相关研究[4-7]证实，家牛有3种Y染色体单倍型组，分别为普通牛Y1和Y2单倍型组以及瘤牛Y3单倍型组。Gotherstrom等[3]对欧洲牛的MSY区多个SNPs标记发现2个位点(UTY-19和ZFY-5)可分离Y1和Y2单倍型组，推测Y1单倍型组起源于欧洲野牛；Ginja等[4]利用Y-SNPs(DDX3Y、UTY-19和ZFY)、1个Indel(ZFY-10)和Y-STRs(IRNA124、IRNA189、BM861、UMN0103、UMN0307和UMA0504)标记对葡萄牙本土13个牛品种、外来牛3个品种及婆罗门牛品种的遗传多态性和父系起源进行调查，揭示了葡萄牙本地牛品种的单倍型及品种间的遗传关系；Edwards等[5]利用Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)和Y-STRs(IRNA189和BM861)标记对欧洲和亚洲共138个牛品种进行分析，结果表明：欧洲牛只携带普通牛单倍型组(其中Y1单倍型组主要分布于欧亚大陆北部，Y2单倍型组主要分布在中欧地区)；而瘤牛Y3单倍型组主要在西南亚地区占明显优势。

我国作为牛品种极为丰富的国家，拥有53个地方黄牛品种[2]，根据外形特征、地域分布和气候特点又可将黄牛分为北方黄牛、南方黄牛和中原黄牛。迄今为止，周艳等[8]利用线粒体DNA多态性对昭通牛群体遗传多样性及变异特征进行了研究，但有关昭通牛Y染色体的父系起源、遗传多样性和种群遗传结构等方面的研究未见报道。因此，本研究利用2个Y-SNPs标记(UTY-19和ZFY-10)和2个Y-STRs标记(IRNA189和BM861)联合分析的方法，对昭通牛的父系起源、遗传多样性和群体遗传结构进行探究，以期为今后开展昭通牛的分子育种和资源保种工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 采样及基因组DNA提取

在云南省昭通市威信县三桃乡昭通牛分布区，采集公牛耳组织样，于75%酒精中保存，带回实验室。采取常规酚—氯仿抽提法对基因组DNA进行提取，稀释至10～20 ng/μL保存备用。

1.2 引物合成和PCR扩增

参照已发表的家牛Y染色体2个Y-SNPs标记(UTY-19和ZFY-10)和Y-STRs标记(IRNA189和BM861)的引物信息[3-5]合成4对引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系(12.5 μL)：2×Es TaqMasterMix(Dye) 6.00 μL，Sterile ddH2O 5.00 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.25 μL，模板DNA 1.00 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，Tm(表1)退火30 s，72 ℃延伸30 s，36个循环；72 ℃充分延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶(含Goldview核酸染料)电泳后，凝胶成像系统检测，将检测合格的产物送至上海生物工程有限技术公司进行测序分析。

1.3 产物测序和单倍型分析

将PCR纯化产物送至生工生物工程股份有限公司(上海)用3730XL型DNA测序仪进行正、反向测序，测序结果通过Chromas 2.6.5软件进行查看和校正，得到每头昭通公牛的2个Y-SNPs标记(UTY-19和ZFY-10)测序序列。2个Y-STRs标记的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行荧光分型，获得INRA189和BM861等位基因大小。结合Y-SNPs和Y-STRs标记的数据，获得昭通牛公牛的单倍型(Y-SNPs-INRA189-BM861)，再用Arlequin 3.11软件进行单倍型多样度计算。

表1 家牛2个Y-SNPs标记和2个Y-STRs标记的相关信息

2 结果与分析

通过对24头昭通牛2个Y-SNPs多态性标记测定序列比对分析，结果表明：UTY-19标记仅有一种C>A颠换突变，频率为100%；ZFY-10标记存在C>T转换突变，频率为70.83%。根据Gotherstrom和Ginja[3-4]等对Y染色体单倍型的判定标准，昭通牛公牛存在Y2和Y3两种单倍型组(表2)。其中7头昭通牛属于普通牛Y2单倍型组，所占频率为29.17%；19头昭通牛属于瘤牛血统Y3单倍型组，所占频率为70.83%。表明昭通牛的父系起源以瘤牛为主，且其地域分布属于南方黄牛类型，与中国南方黄牛的起源进化相一致。

表2 昭通牛Y染色体单倍型与单倍型频率

利用2个Y-STRs标记荧光分型，结果表明：昭通牛在INRA189标记中只有2个等位基因，大小分别为88 bp和90 bp；昭通牛在BM861标记中存在156 bp和158 bp 2个等位基因(表2)。结合2个Y-SNPs和2个Y-STRs标记联合分析，确定昭通牛群体存在两种单倍型：Y2-90-158和Y3-88-156(表2)，频率分别为29.17%(7/24)和70.83%(17/24)，表明昭通牛有普通牛和瘤牛2个父系起源。昭通牛群体的Y染色体单倍型多样度为0.4312±0.0812，表明其遗传多样性较高。

3 讨 论

近年来，随着测序技术的发展，对Y-SNPs和Y-STRs标记多态性的研究极大地推动了家牛父系遗传多样性及群体遗传结构的研究进程。常振华等[9]利用4个Y-SNPs(DDX3Y-7、UTY-19、ZFY-9和ZFY-10)标记分析了中国黄牛16个品种以及4头缅甸牛的Y染色体遗传多样性，结果显示中国黄牛存在Y2和Y3两种单倍型组，且自北到南Y2单倍型组频率逐渐降低，而Y3单倍型组频率逐渐增加；缅甸牛均为Y3单倍型组。Cai等[6]通过2个Y-STRs(UMN2404和UMN0103)分子标记对25个中国黄牛品种进行多态性分析，结果发现南方地区的瘤牛等位基因频率占92.4%，而北方地区的普通牛等位基因频率占95.5%；并推测海南岛可能是瘤牛的起源地，而西藏牛可能是另一个支系驯化而来。Li等[7]利用4个Y-SNPs和2个Y-STRs对中国16个黄牛品种的Y染色体多态性进行分析，统计各种单倍型组的频率得出的结果与Cai等[6]研究结果基本一致。诸多研究结果证实，中国黄牛的单倍型组分布具有明显的地理结构特征，这与mtDNA相关研究[10-11]、历史及地理信息结果一致。

Xia等[12]分析了我国34个中国黄牛品种Y-SNPs(UTY19和ZFY10)和Y-STRs(INRA189和BM861)的多态性，结果表明：中国黄牛存在14种单倍型，其中Y2-104-158和Y2-102-158是中国北部和中部最常见的普通牛单倍型，而瘤牛单倍型Y3-88-156在中国南方占优势；单倍型Y2-108-158、Y2-110-158、Y2-112-158和Y3-92-156是中国牛所特有的。本研究同样采用Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)和Y-STRs标记(INRA189和BM861)结合的方法[4-7]，确定昭通牛有Y2-90-158和Y3-88-156两种单倍型，其中Y3-88-156单倍型占主导地位(70.83%)，说明昭通牛主要是瘤牛父系起源，这与昭通牛在中国的地理分布相一致。基于mtDNA D-loop区多态性分析，周艳等[8]首先报道了昭通牛是以普通牛为主的母系起源。随后，Xia等[11]对中国黄牛mtDNA D-loop区遗传多态性进行评估，发现昭通牛主要存在普通牛单倍型组T3(52.4%)和瘤牛单倍组I1(33.3%)两种母系起源，结合本研究结论证实昭通牛为普通牛与瘤牛起源，与其品种的形成历史相一致[1-2]。本研究中，24头昭通牛的单倍型多样度为0.4312±0.0812，稍高于Edwards等[5]报道的138个国外牛品种的平均单倍型多样度0.422±0.3，低于Li等人[7]揭示的中国16个黄牛品种的单倍型多样度0.6831±0.0134，说明昭通牛群体遗传多样性相对较高。目前，昭通牛品种逐渐受到国外引入肉牛品种西门塔尔牛和我国自主培育的肉牛品种云岭牛的杂交，杂交公牛多实行育肥出售，导致昭通牛原有的遗传资源正在逐渐减少。因此，建议建立昭通牛保种区或保种场，加强纯种选育、提高和保护，避免其遗传资源的流失，为我国肉牛新品种培育提供育种素材。