史颖超， 项门们， 汪富文， 李思华， 史芯蓓， 雷初朝， 党瑞华*

(西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

水牛(Bubalus babulis)是世界牛遗传资源的重要组成部分，其主要分布在亚洲地区且饲养数量占据该地区90%以上，根据亚洲水牛的外形特征、生活习性和生产用途将其分为沼泽型和河流型两种类型，是热带和亚热带地区独具特色的一个物种[1-2]。在中国，水牛在数量上仅次于黄牛，排名第二。作为贵州所特有的水牛品种，贵州白水牛主要产自黔北地区，具有被毛颜色独特、抗病力强、役用性能好、屠宰性能高、繁殖性能良好等优点。据《贵州省畜禽品种志》记载贵州的水牛属于沼泽型水牛，灰色被毛的水牛占到总数的73.19%，少部分为白色，占总数的5.7%[3]，其中白色对灰色表现完全显性。近年来，由于不科学的选育与保种不当、近亲交配等原因，导致白色被毛水牛品种严重退化，群体数量不断递减[4]。皮、毛的颜色作为家畜最直观的外部表型，不仅对其经济价值有很大影响，还是品种的重要特征之一，与毛色性状相关的候选基因多态性不仅是可以利用的良好遗传标记，在确定杂交组合和品种纯度等方面也有重要用途，此外还有研究表明动物的毛色与乳、肉等生产性能有直接的关系[5]，对毛色与疾病的相关性研究也为诊断和治疗相关疾病提供了理想的参考。本试验旨在分析贵州白水牛的白色被毛形成的内在分子机制，以丰富对其品种资源遗传特征的认识，为今后白水牛品种的保种和选育提供科学的指导。

牛的毛色主要是由皮肤和毛发中的真黑色素(褐与黑)与伪黑色素(红与黄)的相对数量与分布情况所决定的[6]。许多研究表明，ASIP基因、MC1R基因和TYR基因是控制牛、羊等哺乳动物毛色的重要主效基因，这些基因的突变可能引起动物毛色性状的改变，故本试验通过对这3个基因的多态性研究，试图从中分析得到贵州白水牛白色被毛形成的原因。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在不同品种饲养管理条件基本相同的情况下选取健康无病、精神状态良好、被毛光泽、颜色均一的水牛为样本，40头贵州水牛(20头贵州白水牛和20头贵州灰水牛)选自贵州省遵义市凤岗县养殖厂的水牛个体，剪取耳组织为样本；40头普通黑水牛采取随机抽样的方式从宜宾水牛育种场采集血样，每头牛采集10 mL颈静脉血样置于抗凝血采血管中，震荡混匀后置于-80 ℃保存。

1.2 提取DNA和构建DNA池

血液样本采用全血/组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒，提取血液基因组DNA；耳组织样本采用磁珠法动物组织基因组DNA抽提试剂盒提取其DNA，用NanoDropTM 1000 Spectrometer(Thermo Fisher Scientific)检测DNA浓度及纯度(OD260/280，OD260/230)，并将水牛DNA样品的浓度调整至50 ng/μL。从10头贵州白水牛的DNA样品中各取5 μL混合在一起构建贵州白水牛的DNA池，从10头贵州灰水牛耳部肌肉组织样DNA中各取5 μL均匀混合在一起构建灰水牛的DNA池，从20头宜宾水牛颈静脉血样DNA中各取5 μL混合在一起构建普通黑水牛的DNA池。

1.3 引物设计和PCR扩增

参照NCBI数据库GenBank中提供的水牛(buffalo)ASIP基因序列(NC_037558.1)、MC1R基因序列(AC_000175.1)、TYR基因序列(AC_000186.1)，用Primer 3.0 Plus软件设计这3个基因的启动子、外显子、3′-UTR和5′-UTR的特异性引物，引物由上海生工Sangon Biotech生物公司合成(详见表1～3)。

PCR反应总体系25 μL，其中ddH20 9.5μL，Mix(包括PCR稳定剂和增强剂、Mg2+、dNTPs、Taq DNA Polymerase、PCR Buffer))12.5 μL，上游引物F和下游引物R各1 μL，水牛DNA 1 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；设计不同的退火温度30 s，72 ℃延伸30 s，共32个循环；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳30 min检测，通过电泳检测结果，判断引物是否合适，并确定最适退火温度。

1.4 序列测序及分析

以贵州白水牛、贵州灰水牛和普通水牛分别构建的DNA池作为DNA模板进行特定部分PCR扩增，将PCR扩增产物送去上海生工生物工程股份有限公司进行正、反测序。测序结果用SeqMan进行对比分析寻找突变位点。

1.5 扩大样本验证

针对以DNA池为模板检测出来的突变位点，利用剩下的10头贵州白水牛个体、10头贵州灰水牛个体和20头普通水牛个体的DNA样本为模板对突变位点所在的区域进行PCR扩增，测序分析，对比筛选到的突变位点是否具有特异性，能否解释品种间毛色的差异。

表1 ASIP引物设计

表2 MC1R引物设计

表3 引物设计

2 结果与分析

通过对测序结果的分析，发现贵州白水牛的ASIP、MC1R和TYR基因都存在多态位点，以MC1R基因第一外显子第一位碱基计数为1，贵州白水牛的SNPs位点为：exon 1-G617A、exon 1-T843C，这2个SNPs位点在贵州灰水牛和部分普通水牛个体中同样存在，不具有特异性，详见图1；以TYR基因每一外显子第一位碱基计数为1，贵州白水牛的SNPs位点为：exon 1-G826A、exon 3-A83G、exon 5-T70C和exon 4-C170A，这4个SNPs位点在贵州灰水牛和普通水牛中同样存在，不具有特异性，详见图2；以ASIP基因第一外显子第一位碱基计数为1，贵州白水牛的SNPs位点为：Promoter-A147T和Promoter-A235G，该突变在部分普通水牛个体样本中同样存在，故在白水牛品种中不具有特异性，不能解释白色被毛形成的原因，详见图3。

B：exon 1-T843 C Q：exon 1-T843 C

B：exon 1-G826A exon 3-A83G exon 5-T70C

Q：exon 1-G826A exon 3-A83G exon 5-T70C

3 结 论

利用在线软件https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html预测贵州白水牛MC1R基因及TYR基因突变前后蛋白质二级结构的变化，发现在MC1R基因中exon 1-T843C为错义突变，导致缬氨酸(Val)变成丙氨酸(Ala)；TYR基因中exon 1-G826A和exon 5-T70C为错义突变，分别导致精氨酸(Arg)突变为组氨酸(His)、亮氨酸(Leu)突变为异亮氨酸(Ile)，exon 3-A83G为同义突变；在ASIP的启动子中发现了2个SNPs位点：Promoter-A147T和Promoter-A235G。扩大个体样本进行测序验证这些SNPs位点，发现它们在贵州白水牛中不存在特异性，在其他非白水牛的个体中也有同样突变，故不能解释贵州白水牛白色被毛形成的分子机制，对其毛色形成原因的分析，有待下一步试验探讨。

4 讨 论

ASIP和MC1R是哺乳动物体内调控毛色的2个重要候选基因，ASIP的表达会引起褐黑素的产生，MC1R的表达会引起真黑素的产生，许多研究表明，MC1R基因与ASIP基因共同通过控制红/黄褐黑素和黑/棕真黑素之间的相对数量，从而控制动物的毛色[7]。一方面ASIP基因编码Agouti信号蛋白(agouti signaling protein,ASIP)[8]，ASIP是一种旁分泌信号分子，对G蛋白共轭型受体有天然的拮抗作用，以竞争方式对黑色素细胞刺激激素受体(MSHR)起拮抗作用，引起环腺苷酸水平下降而产生棕黑素；另一方面，ASIP还可以下调MC1R信号，通过氨基末端，降低TYR和Dct(多巴色素异构酶)水平[9]，通过以上这2种方式，ASIP使真黑素合成过程停止，转为合成褐黑素，从而使皮毛表现为黄色或红色。此外，ASIP基因还编码一种Agouti基因相关蛋白(agouti-related protein, AgRP)，AgRP的N末端可以除去与ASIP具有高亲和性的MC4R，使ASIP产生生理作用，从而达到与ASIP共同调节动物毛色的功能[10]。结合国内和国外已有的研究表明，MC1R基因是调控牛毛色的重要候选基因之一，具有不同MC1R基因型的牛，其毛色存在差异。早期的研究发现，牛MC1R基因有ED、E+和e 3种基因型，Francois等在2000年通过COP-PCR的方法在牛中还检测到一种新的基因型E1[11]。TYR基因是编码酪氨酸酶的基因，酪氨酸酶是黑色素形成过程中的关键酶，其表达量和活性决定了黑色素生成的速度和多少。黑色素是多巴醌、吲哚-5,6醌和多巴色素的聚合物，酪氨酸酶正是把酪氨酸转化成多巴的中介，多巴再被氧化成多巴醌，进一步转变为各种衍生物组合构成黑色素。鉴于酪氨酸酶对黑色素形成的重要性，TYR基因也被列为与毛色性状有关的重要研究基因之一。许多研究都表明，这3种基因的遗传多态性与动物的毛色性状显著相关。

研究一方面在贵州白水牛MC1R基因和TYR基因中筛选到突变位点，验证了敖啟燕等[12]对贵州水牛毛色研究的结果，同时扩大了水牛品种分析的范围，但发现这些SNPs位点在其他黑水牛品种中也存在，不具有特异性，因此不能解释其特殊白色被毛形成的原因。接下来，笔者准备扩大群体分析这些突变位点在贵州白水牛和非白水牛品种之间的突变频率是否有显著差异，因为毛色也可能是多基因控制。另一方面，毛色相关基因很多，本研究初步分析了3个毛色相关基因的突变情况，可以为下一步寻找其他可能的因果基因奠定基础，试验结果丰富了我们对贵州白水牛毛色性状遗传机理的认识，也为贵州白水牛的分子选育工作提供了一定的理论依据。