亐开兴， 王凯悦， 张继才， 黄必志， 陈宁博， 冯光杰， 李顺东， 陈 宏， 雷初朝*

(1.云南省草地动物科学研究院，昆明 650212；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；3.云南谷多农牧业有限公司，云南 广南 663300)

文山牛又名文山高峰牛，属役肉兼用型地方黄牛品种，主要分布于云南省文山壮族苗族自治州的文山、砚山、西畴、麻栗坡、马关、丘北、广南、富宁八县，其中广南、富宁、丘北、砚山等县海拔900 m以上、旱地面积较大的地区分布较多，以广南、富宁两县结合部的百乐—坡油一带的文山牛最为出名[1]。文山牛体躯结实匀称，力大耐劳，繁殖力较强，性情温顺，能适应干燥寒冷和潮湿炎热的气候，是一个优良的役用地方黄牛品种，并具有较好的肉用性能[2]。

Y染色体单倍型频率和地理分布可以提供有关迁徙、雄性基因流以及系统发育关系等信息[3]，因此，Y染色体特异性标记已被广泛用于研究人类与动物的父系起源。近年来，基于Y染色体单核苷酸多态性标记(Y—SNPs)研究结果，定义了普通牛Y1、Y2和瘤牛Y3单倍型组，以及一个新的Y1.2单倍型组[4-6]。常振华等[7]利用Y—SNP标记，发现中国黄牛以Y2和Y3单倍型组为主，Y2单倍型组在北方牛群体中占优势，Y3单倍型组在南方牛群体中占优势。而关于家牛Y染色体STR变异研究，Edwards等[8]首先评估了4个Y-STR特异性标记在家牛以及相关物种中的遗传多态性。随后，Cai等[9]研究发现2个Y—STR位点(UMN2404和UMN0103)可用于区分普通牛和瘤牛血统。近年来，国内外越来越多的研究已经将二者结合起来分析黄牛群体的Y染色体单倍型结构和父系起源历史[10-11]。Xia等[12]分析了34个中国黄牛品种/群体的Y—SNPs和Y—STRs多态性，结果表明中国黄牛存在丰富的父系遗传多样性，并且可能拥有许多起源于近东驯化中心的原牛血统。

我国幅员辽阔，自然环境复杂多样，孕育了十分丰富的黄牛遗传资源，到目前为止，大多数关于文山牛品种遗传多样性的研究主要集中于线粒体水平。文际坤等[13]通过分析线粒体DNA限制性片段长度多态性(mtDNA RFLP)，表明文山牛同时具有普通牛和瘤牛母系起源，以瘤牛血统为主。随后，钱林东等[14]测定了文山牛mtDNA D—loop区全序列并对其群体遗传变异进行分析，结果同样支持云南文山牛具有普通牛和瘤牛两种母系血统来源。然而，关于文山牛Y染色体遗传多样性及父系起源的研究较少。Gou等[15]通过比较文山牛的线粒体控制区和Y染色体基因片段，线粒体数据表明，文山牛存在普通牛和瘤牛两种母系起源，以瘤牛血统为主；而Y染色体系统发育表明，文山牛的父系起源几乎都是瘤牛。此外，Xia等[12]利用Y-SNPs结合Y-STRs的单倍型分型方法，对20头文山牛的父系起源进行了调查，表明文山牛含有Y2和Y3两种父系起源。但之前的研究用到的样本量较少，对文山牛群体的代表性较低。因此，本研究利用Y-SNPs(UTY19和ZFY10)和Y-STRs(INRA189和BM861)标记，对55头文山牛进行单倍型分析和父系起源研究，为加强云南文山牛种质资源保护和开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集与基因组DNA提取

在云南谷多农牧业有限公司那朵牧场采集55头文山牛公牛的耳组织样带回实验室，采用苯酚—氯仿方法[16]提取全基因组DNA，提取的基因组DNA

放在-20 ℃保存备用。用本实验室保存的5头荷斯坦牛公牛DNA做对照。

1.2 引物合成与PCR扩增

参照Götherström等[5]和Ginja等[16]报道的2个家牛Y-SNP标记(UTY19和ZFY10)引物序列信息合成引物(表1)，参照Edwards等[10]发表的2对Y-STR标记(INRA189和BM861)引物序列信息合成引物(表2)。

PCR反应体系为12.5 μL：ddH2O 5.00 μL，2×Taq MasterMix 6.00 μL，上下游引物各0.25 μL(10 pmol/μL)，模板DNA 1.00 μL。扩增条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s(退火温度见表1和表2)，72 ℃延伸30 s，36个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用2%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，将检测合格的PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序与分型。

表1 2对Y-SNP引物信息

表2 2对Y-STR引物信息

2 数据统计分析

结合已经发表的家牛序列(GenBank登录号分别为AY936543和AF928827)，将UTY19和ZFY10测序结果用SeqMan v7.1软件进行比对分析，找出相应的SNP位点。用GeneMarker V1.91软件对荧光微卫星标记INRA189和INRA189的等位基因大小进行统计。由于不同酶对微卫星结果会产生1～2 bp的影响，所以本研究同时使用荷斯坦牛微卫星数据做校正，以保证结果的准确性。每个个体的单倍型都是利用Y-SNPs先确定家牛的单倍型组，继而结合Y-STRs分型，二者共同确定出每头牛的Y染色体单倍型(Y—SNP—INRA189-BM861)。用Arlequin V3.11软件计算单倍型频率和单倍型多样度(H±SD)。

3 结果与分析

3.1 文山牛Y—SNPs多态性

将55头文山牛2个Y—SNPs标记(UTY19和ZFY10)的PCR扩增产物的测序结果，与Götherström等[5]和Ginja等[4]报道的家牛序列(GenBank登录号：AY936543和AF928827)进行比对分析，结果表明：2个Y—SNPs标记在55头文山牛中均不具有多态性。与标准序列相比，UTY19标记全部为C>A核苷酸颠换，而ZFY10标记全部为C>T核苷酸转换。参考 Götherström等[5]和Ginja等[4]对家牛Y染色体单倍型组的判定标准，依据2个标记的核苷酸变异确定单倍型组，结果显示，55头云南文山牛均为Y3单倍型组，对照组荷斯坦牛均为Y1单倍型组。

3.2 文山牛Y—STRs多态性

利用2个Y—STRs标记(INRA189和BM861)，对55头文山牛Y染色体多态性进行检测。在INRA189座位中共检测到88 bp和90 bp两个等位基因，所占个体数分别为49头和6头，均对应瘤牛Y3单倍型组；在BM861座位中仅检测到一种等位基因(156 bp)，对应瘤牛Y3单倍型组。对照组荷斯坦牛在INRA189座位中为98 bp等位基因，在BM861座位中仅检测到一种等位基因(158 bp)。

3.3 文山牛Y染色体单倍型频率和单倍型多样度

参照Edwards等[10]报道的Y—SNPs和Y—STRs标记结合的单倍型分型方法，对55头文山牛的单倍型(Y—SNP—INRA189—BM861)进行分析，发现55头文山牛均为Y3单倍型组，但有2种单倍型Y3—88—156和Y3—90—156，其中Y3—90—156单倍型频率为0.09，Y3—88—156单倍型频率为0.91，文山牛Y染色体单倍型多样度为0.1684±0.0636；所有的荷斯坦公牛对照组都是Y1-98-158单倍型。

4 讨 论

本研究旨在全面了解南方黄牛文山牛品种中Y染色体的遗传多样性，并提供父系起源和群体结构的分子证据。Götherström等[5]首次从180个现代家牛样本Y染色体基因中(DBY、UBE1Y、UTY19和ZFY10)找到了Y—SNP标记，成功区分出家牛的3种Y染色体单倍型组，即普通牛Y1、Y2和瘤牛Y3单倍型组。随后不断有报道验证了Y—SNP标记在研究家牛父系起源的重要作用[7,10,12]。相比Y—SNP标记，Y—STR标记具有突变率高、多态性丰富等特点。Edwards等[8]利用不同牛种对4个牛Y—STR标记(INRA126、INRA124、INRA189和BM861)的特异性进行筛选，结果表明，INRA124、INRA189和BM861标记在家牛中均展现出普通牛和瘤牛的特异性。INRA189和BM861标记作为2个经典标记，在本研究中只有INRA189表现出多态性。

Li等[11]对中国16个地方黄牛品种Y—SNP和Y—STR进行多态性分析，发现中国黄牛有普通牛和瘤牛两种父系起源，其中，北方黄牛以普通牛Y2为主，南方黄牛以瘤牛Y3为主。利用Y—SNPs和Y—STRs标记，李芳玉等[17]、侯佳雯等[18]分别对大别山牛和皖南牛的遗传多样性和父系起源进行研究，发现大别山牛和皖南牛这两种南方黄牛均以瘤牛为主要的父系起源。然而，大多数关于文山牛品种遗传多样性的研究主要集中于线粒体DNA。不同于线粒体DNA和常染色体DNA的遗传特征，Y染色体分子遗传标记反映了动物父系遗传特征，提供父系起源证据[19]。本研究采用Y—SNPs和Y—STRs相结合的单倍型分型方法(Y—SNP—INRA189—BM861)，对55头文山公牛进行了单倍型分析，定义出文山牛2种Y染色体单倍型(Y3—88—156和Y3—90—156)，其中Y3—88—156单倍型占明显优势(0.91)，这说明文山牛具有与中国南方黄牛相似的血统来源，即以Y3—88—156瘤牛单倍型为主[12]。结果表明，文山牛只有瘤牛父系起源，这与Gou等[15]认为文山牛父系起源几乎均为瘤牛研究结果相吻合。此外，也与最近Xia等[12]报道的对文山牛研究结果一致，20头文山牛存在Y2—102—158和Y3—88—156两种单倍型，其单倍型频率分别为0.05和0.95。

单倍型多样度是衡量一个群体变异程度的重要指标，单倍型多样度高的群体说明其遗传多样性高，遗传资源丰富。Edwards等[10]报道138个国外牛品种的单倍型多样度平均值为0.422±0.269，Li等[11]研究发现中国16个中国黄牛品种的单倍型多样度平均值为0.2258±0.0882，Xia等[12]研究发现34个中国黄牛品种的平均单倍型多样度为0.607±0.016，均大于本研究调查的文山牛单倍型多样度(0.1684±0.0636)，然而本研究结果和Xia等[12]研究发现文山牛单倍型多样度(0.100±0.088)接近，这表明文山牛的分子遗传多样性较低，可能与采样地区的公牛有效群体较小有关；另一方面，也说明文山牛父系种质资源比较纯正，遗传稳定，纯合度高。