孟凡恒，李佳佳，董兴童，李书凝

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学 中医学院，山东 济南 250355；3.山东中医药大学 理工学院，山东 济南 250355)

仙鹤草是蔷薇科、龙芽草属多年生草本植物。其性味苦，涩，平；归心、肝经；具有收敛止血，截疟，止痢，解毒，补虚的功效[1]。现代研究证明鞣质类成分是仙鹤草的主要有效成分之一[2]，本实验拟采用溶剂提取法中的乙醇减压回流提取法获得仙鹤草的乙醇提取物，再综合运用层析法对目标化合物进行富集、分离，应用化学方法和高效液相法进行鉴定。

1 实验仪器与试剂

DFY-500型 500 g 摇摆式高速中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司)，BS 214D 型1/1 万分析电子天平(北京 Sartorius公司)，BT 25S 型1/10 万分析电子天平(北京Sartorius公司)，SZCL-2-5000 mL型磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)，层析柱(30×500 mm)，旋转蒸发器(巩义市予华仪器有限责任公司)，高效液相色谱仪(品牌：岛津；型号：LC-10ATVP)。

仙鹤草(北京同仁堂亳州饮片有限责任公司，产品批号：701002013)经山东中医药大学药学院李慧芬副教授鉴定该饮片为蔷薇科植物龙芽草属仙鹤草Agrimonia pilosa Ledeb.的全草，没食子酸对照品(上海源叶生物科技有限公司，产品批号：YN1105MA14)，丹宁酸对照品(上海源叶生物科技有限公司，产品批号：20180529)，NKA-9型大孔树脂(上海源叶生物科技有限公司)，硅胶(青岛海洋化工有限公司)，CMC-Na(国药集团化学试剂有限公司)，乙醇，苯，乙酸乙酯，甲酸，甲醇(色谱纯，其余均为分析纯)。

2 实验步骤

2.1 仙鹤草有效成分鞣质的提取

2.1.1 仙鹤草乙醇提取物的制备

将原饮片仙鹤草用中药粉碎机粉碎，得到粒径大小为2～4 mm的药品颗粒，使其与乙醇试剂充分接触反应，取粉碎后的药品200 g，置5000 mL圆底烧瓶中，加入90%乙醇1000 mL浸泡3 d，温度控制在45～50℃条件下减压回流提取2 h[3]，抽滤分离药渣和提取液，弃去药渣。将提取液倒入圆底烧瓶，在48℃条件下减压回收乙醇，回收至提取液剩余约80 mL，抽滤去除难溶于水的杂质，滤液自然冷却后加蒸馏水稀释至300 mL密封保存备用，得仙鹤草的乙醇提取物，记为试剂A。

2.1.2 仙鹤草乙醇提取物的定性分析

分别取试剂A1mL于两个试管中，记为试管m、n，试管m中滴加4%明胶水溶液，出现沉淀，证明滤液中含有鞣质；试管n滴加2～3滴3%三氯化铁溶液，溶液变为深蓝色，证明溶液中含有邻三酚羟基化合物，存在水解鞣质和没食子儿茶酸缩合鞣质[3]。

2.2 仙鹤草乙醇提取物成分的分离

取200 mL试剂A，分别用1000 mL60%乙醇溶液、1000 mL70%乙醇溶液、1000 mL80%乙醇溶液在NK-9型大孔树脂中进行梯度洗脱，分别得到样品1、样品2、样品3，用3%三氯化铁溶液进行成分鉴别反应，样品1显阳性，样品2和样品3显阴性。

采用湿法装柱，湿法上样，用硅胶色谱柱对样品1内的成分进行进一步分离提取，用5倍样品体积60%乙醇溶液进行洗脱，得到样品4、样品5、样品6、样品7，即为供试溶液。

2.3 仙鹤草乙醇提取物的色谱检识

2.3.1 薄层层析法检测鞣质类成分

2.3.1.1供试品与对照品的制备

供试品：取试剂A1mL于试管中，记为P。

对照品：精密量取对照品没食子酸0.00700 g，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得各自的对照品溶液，记为Q，没食子酸对照品：0.700 mg/mL。

2.3.1.2薄层层析方法

展开板硅胶G加 0.6% CMC-Na，手工制板，晾干，105℃活化 1 h。点样：P、Q。展开剂∶V(苯)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲酸)=80∶50∶8。展开方式为卧式上行[4]。

2.3.1.3薄层层析结果

经薄层展开后，置254 nm紫外灯下检视 ,没食子酸斑点显蓝紫色荧光。喷醋酸-亚硝酸钠-氢氧化钠显色剂 ,没食子酸斑点显亮黄绿色。说明供试品中含有可水解鞣质。

2.3.2 高效液相法检测仙鹤草乙醇提取物

2.3.2.1对照品溶液的制备

精密量取对照品没食子酸0.00350 g，丹宁酸0.00391 g，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得各自的对照品溶液，没食子酸对照品：0.350 mg/mL，丹宁酸对照品：0.391 mg/mL。

2.3.2.2色谱条件

流动相：60%甲醇，流速：1.0 mL/min，进样量：40 μL，柱温：30℃，检测波长：210 nm。得到波谱数据见图1～5以及表1～4。

图1 没食子酸对照品的高效液相色谱图

图2 丹宁酸对照品的高效液相色谱图

峰号试剂保留时间/min峰高峰面积含量/%0000没食子酸对照品4.107688218.125144005181000001丹宁酸对照品3.573144980.0781662021.75100

表2 样品4的HPLC分析结果

图3 样品4高效液相色谱图

图4 样品5高效液相色谱图

图5 样品6高效液相色谱图

2.4 最低检出限的测定

配制系列不同浓度的丹宁酸对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，信噪比S/N约为3时，检出限为30 μg/mL。

2.5 精密度实验

取同一份丹宁酸与没食子酸混合对照品溶液，重复进样6次，测定每次对照品溶液的峰面积，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为1.86%、1.44%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验

取6份样品4分别进样分析，结果显示峰1，2，3峰面积RSD(n=6)分别为1.33%、1.90%、1.45%，表明仪器的重复性良好。

2.7 稳定性实验

取样品4每隔4 h进样分析，结果显示峰1，2，3峰面积RSD(n=6)分别为1.97%、1.49%、1.77%，表明仪器的稳定性良好。

2.8 加样回收率实验

精密称取仙鹤草粉末10 g，如上述步骤进行提取，向提取液中加入一定量的标准品，测得加样回收率为95.69%，RSD值为1.72%。

3 小结

仙鹤草单方或复方对治疗内外妇儿科等疾病都有着较好的疗效,值得临床推广。然而，目前对仙鹤草的作用机制尚不清楚，研究分析不够深入，在应用方面局限于皮革食品和某些金属工业领域[5]，且仙鹤草临床研究的病例也太少，多为经验方，缺乏严格系统得临床观察和统一的诊疗标准[6]。本文所述实验研究采用乙醇减压回流提取法获得仙鹤草的乙醇提取物，再运用大孔树脂与硅胶层析法对鞣质进行富集、分离，通过薄层色谱与鉴别反应追踪目标化合物，再利用高效液相进行进一步分析鉴定，根据结果分析，用乙醇提取出鞣质，15倍量的60%乙醇可以洗脱出鞣质，样品6的峰5为鞣质，重复性精密性较好，且方法简便，容易操作，为仙鹤草乙醇提取物中鞣质的研究提供了一定的借鉴意义。

4 讨论

鞣质，又称丹宁，是存在于植物体内的一类结构比较复杂的多元酚类化合物，为黄色或棕黄色无定形松散粉末，在空气中被氧化颜色逐渐变深，有强吸湿性，因此实验过程中应尽量控制提取物与空气的接触时间，为避免提取时糊底，粒径控制在2～4 mm；鞣质温度过高不稳定，故温度控制在50℃以下，样品7浓度低于检出限，未检出波谱数据；但检出的鞣质含量较小，50%乙醇洗脱可能得到更高浓度的鞣质；本实验研究仙鹤草全草中鞣质的含量，可以进行不同部位的含量研究，从而确定有效部位。