CBX2蛋白在胃癌中的表达水平及临床意义

2019-08-02何怡岚张波

世界华人消化杂志 2019年14期

何怡岚,张波

何怡岚,杭州市余杭区第三人民医院肿瘤内科浙江省杭州市 311115

张波,浙江省肿瘤医院中西医结合肿瘤科浙江省杭州市 310022

核心提要：色素框同源物2(chromobox homolog 2,CBX2)在胃癌(gastric cancer,GC)细胞中的表达量高于正常胃黏膜上皮细胞的表达量,GC组织中CBX2 mRNA及蛋白的表达量高于与其配对的癌旁组织并且CBX2在GC组织中的阳性表达率高于癌旁组织,证明了CBX2蛋白的表达与GC患者的疾病转归存在联系.

0 引言

胃癌(gastric cancer,GC)是世界上第四大常见恶性肿瘤,也是继肺癌和肝癌后第三大最常见的癌症死亡原因[1].GC是常见的消化道肿瘤,其发生呈现早起隐匿性,缺乏敏感有效的早期诊断标准[2].尽管目前国内外在GC的早起检测,诊断和临床治疗方面取得了一定程度上的突破,但仍旧无法改变GC患者的整体生存预后情况不容乐观的事实[3].各基因通路的相互作用以及原癌基因和抑癌基因功能的失调等因素与GC的疾病演变关系密不可分.

色素框同源物2(chromobox homolog 2,CBX2)是CBX蛋白家族的主要成员,是调节染色质多梳抑制复合物(polycomb repressive complex PRC)1复合物的一个重要组成部分.CBX2蛋白是参与募集PRC1蛋白至有丝分裂染色体的主要成分[4],而表现出修饰组蛋白并抑制靶基因转录的酶活性.研究证明,CBX2在多种癌症的演变,疾病转归及预后中起到了至关重要的作用[5,6].例如,CBX2在乳腺癌中的表达明显升高,高表达的CBX2与乳腺癌的转移及预后明显相关[7].然而,CBX2影响GC的发生发展机制尚不清楚,本研究采用Western-blot法、Real-Time荧光定量PCR法和免疫组化法检测GC细胞系及组织中CBX2表达情况,并分析CBX2的表达与GC患者的临床病理资料及生存预后情况的关系.

1 材料和方法

1.1 材料选取2008-05/2012-06浙江省肿瘤医院中西医结合肿瘤科收治的66例GC患者的样本.其中男性46例,女性20例；中位年龄为58.4岁.同时收集3例GC患者手术标本,保留GC组织和与其配对的癌旁组织共3对,依次编号为T1(N1)、T2(N2)、T3(N3).采集的标本标号放入EP管后,立刻放入液氮中保存,并封入－80 ℃冰箱保存.患者临床随访资料完备,术前未经化疗及放疗治疗,术后病理组织经本院病理科确诊为GC无疑.本研究通过浙江省肿瘤医院伦理委员会的审核批准,标本的留取及研究均取得患者知情同意.

细胞与实验试剂器材：正常胃黏膜上皮细胞CES-1及GC细胞株MGC-80,BGC-823以及MKN-45均购自美国模式菌种保藏中心.Anti-CBX2(ab80044)抗体购自艾博抗(上海),RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司,胎牛血清购自美国Gibco公司；实时荧光定量测定PCR仪购自美国应用生物系统公司；电热恒温水浴箱购自上海精宏实验设备有限公司；台式离心机购自Thermo公司.微量移液器：型号10 μL,100 μL和1000 μL购自德国Eppendorf公司.紫外分光光度计：型号Nanodrop2000购自Thermo公司；其他：如高压锅、冰箱、低温冰箱、Tip头、386孔板等均购自上海鼎盛生物有限公司.

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学结果判定：每张组织切片随机选取10个高倍镜视野,平均每个视野需计数100个细胞,根据细胞的染色强度和阳性比例得出实验结果.根据染色强度分级为0(无着色),1(淡黄色),2(棕黄色),3(棕褐色).根据显色的肿瘤细胞的百分比,评分如下：0(＜10%)、1(10%-49%),2(≥50% ).最终的结果为两项得分相乘,阳性(≥2分)或阴性(＜2分).

1.2.2 Western blot检测：收集对数生长期细胞并使用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白,使用BCA法测定蛋白浓度后置于-80 ℃条件下保存.将样本蛋白加入上样缓冲液后,使用98 ℃干浴变性5 min.制备适当浓度的浓缩胶及分离胶后,依每孔50 μg定量上样,使用110V恒压进行电泳,250 mA横流进行湿转,将蛋白转至合适大小的PVDF膜中.使用5%脱脂奶粉室温封闭2 h后,加入溶有一抗的5%脱脂奶粉液,置于4 ℃摇动孵育过夜,一抗稀释比例为1：1000.在使用TBST溶液清洗PVDF膜后,加入溶有适当比例二抗的5%脱脂奶粉液,于室温下摇动孵育1 h.再次使用TBST溶液清洗膜,使用ECL发光液于暗室进行化学发光检测.

1.2.3 实时荧光定量PCR检测：按照说明书使用Trizol提取总RNA,依据逆转录试剂盒说明进行逆转录反应.依据SYBR Green PCR说明书混合反应体系,以GAPDH为参照系进行qRT-PCR检测.引物经由北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行合成.通过上述方式进行RNA的提取.利用TaqMan™Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0试剂盒对提取后的样本进行扩增.利用7900HT荧光定量PCR系统,以CES-1细胞mRNA表达量作为内参计算每个mRNA的相对表达量.

统计学处理采用SPSS 19.0统计软件包(IBM公司,美国)对所有数据进行统计学分析.运用χ2检验来分析CBX2的表达与临床病理生理特征的关系.采用单变量和多变量Cox比例风险模型计算患者的危险比和95%CI.

2 结果

2.1 CBX2 mRNA在GC细胞,GC组织及其配对的癌旁组织中的表达情况采用Real-time荧光定量PCR法检测GC细胞(MGC-80,BGC-823,MKN-45)中CBX2 mRNA的表达水平与正常胃黏膜上皮细胞CES-1中的表达水平相比,结果显示(图1A),三种不同的GC细胞中CBX2 mRNA的表达量均高于正常胃黏膜上皮细胞CES-1中的表达量(P＜0.05)；而Western-blot法的检测结果(图1B)同样显示,三种GC细胞(MGC-80,BGC-823,MKN-45)中CBX2蛋白的表达量同样高于正常胃黏膜上皮细胞CES-1中的表达量(P＜0.05).

我们采用上述两种方法来检测3例GC组织和与其配对的癌旁组织中CBX2的mRNA和蛋白表达量,结果显示(图1A和B),GC组织中CBX2 mRNA及蛋白的表达量高于与其配对的癌旁组织中的表达量(P＜0.05).

2.2 CBX2蛋白在GC组织及癌旁正常组织中的表达情况采用免疫组织化学染色法检测66例GC组织及其配对的癌旁组织中CBX2蛋白的表达情况,如图2所示,CBX2在GC组织中的阳性表达率为40.9%(27/66),在癌旁正常组织中的阳性表达率为12.1%(8/66),CBX2在GC组织中的阳性表达率高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P＜0.05).

2.3 GC组织中CBX2表达与各临床病理参数之间的关系根据66例GC患者中CBX2的表达情况,分析其与各个临床病理参数之间的关系,结果如表1所示,CBX2蛋白的表达与患者的肿瘤转移情况有关(P＜0.05),与患者的性别,年龄,吸烟史及TNM分期无关(P＞0.05).

2.4 GC组织中CBX2的表达与患者生存期之间的关系采用Kaplan-Meier法分析66例GC患者的CBX2表达情况与生存期的关系,结果如图3显示,CBX2阳性表达患者的生存率与阴性表达患者的生存率无显著差异(P＞0.05).

3 讨论

越来越多的证据表明,包含RNA编辑的表观遗传学改变可能在转录后基因调控中发挥重要作用,并可能控制各种癌症相关基因的表达[8].而癌症相关基因的表达在癌症的发生发展及预后往往起到十分关键的作用[9].PcG蛋白主要形成两种蛋白质复合物,即PRC2和PRC1.而CBX2蛋白可通过蛋白质-蛋白质相互作用将PRC1的其他成分募集到染色质中[10],其在乳腺癌[7],前列腺癌[11],结肠癌[12]等多种肿瘤组织中均有表达,参与促进细胞增殖、侵袭及肿瘤血管的形成.

在本研究中,分别应用蛋白质免疫印迹法和Realtime荧光定量PCR法检测了GC细胞、正常胃黏膜上皮细胞、GC组织及其配对的癌旁正常组织中CBX2 mRNA和蛋白质的表达情况.结果发现,在GC细胞和GC组织中,CBX2 mRNA和蛋白质的表达量均高于正常胃黏膜上皮细胞及配对的癌旁正常组织.本研究同时探讨了CBX2的表达与GC患者的病理参数之间的关系,结果发现,CBX2蛋白的表达与患者的肿瘤转移情况有关；但CBX2阳性表达患者的生存率与阴性表达患者的生存率无显著差异,这可能与本实验所纳入研究的病例数过少有关.