● 钟佳贤 林泽苗 贾欢欢 吴玉娥 曾业文 李青南，▲

骨质疏松症是一种全身性代谢性骨病，其特征在于骨量低和骨微结构破坏，导致骨脆性增加而易发骨折，严重影响患者的生活质量，增加了国家的经济负担[1]。中医学上并无骨质疏松症的病名，“骨痿”“骨枯”“骨痹”与此症相近。骨质疏松症的发病机制与肾脏密切相关，其次与脾胃、肝脏、血瘀等相关[2-4]，中医的治疗方法是滋补肝肾、健脾益气、活血化瘀。中药在骨质疏松症的治疗中具有多靶点、多途径、整体调节的优点，在缓解症状、增加骨量、防治骨质疏松性骨折等方面效果显著[5-6]。然而，近年来，有报道称中药引起的不良反应以及药源性疾病时有发生，其中不乏有肝肾功能损害的报道[7]，医药工作者对中药的安全性给予了广泛的关注。

护骨胶囊上市11年来，现代研究不断进行，关于去势雌性大鼠致骨质疏松模型的骨骼及骨重建状态、血清骨代谢指标、钙相关激素和性激素的影响[8-11]等已发表相关论文，现进一步观察其对去势雌性大鼠主要脏器的影响。

1 材料与方法

1.1实验药物护骨胶囊(广东安诺药业股份有限公司产品，专利号：ZL03117768.9，批号：20150101)。

1.2动物50只3个月大的SPF级雌性非妊娠SD大鼠，体重(210±3)g。由广东省医学实验动物中心提供，动物质量合格证编号：44007200017783。将实验动物饲养于广东省实验动物监测所的笼子中，每笼3～4只(室温23～27℃；相对湿度58%～60%)。

1.3试剂甲醛溶液、石蜡、二甲苯、无水乙醇、盐酸乙醇、TO生物制片透明剂、苏木精液、伊红液、中性树胶。

1.4仪器EG1150H+C Leica组织包埋机、TP1020 Leica自动脱水机、RM2255 Leica全自动轮转切片机、HI1210 Leica摊片机、HI122 Leica烘片机、DM55 Leica生物显微镜，均购自德国徕卡仪器公司。

1.5实验方法按随机函数将大鼠分为5组：假手术组(Sham组)、卵巢切除组(OVX组)和护骨胶囊低剂量组(HG-L组)、护骨胶囊中剂量组(HG-M组)、护骨胶囊高剂量组(HG-H组)，每组10只。假手术组将SD雌性大鼠在适应性喂养2周后，使用2%戊巴比妥钠注射腹腔，去除卵巢周围的部分脂肪，而其它组按照相同的方法操作，麻醉后去除双侧卵巢。手术后2天开始给药，Sham组和OVX组灌服生理盐水[10ml/(kg·d)]，HG-L、HG-M和HG-H组分别灌服等体积的护骨胶囊[分别为0.243g/(kg·10ml·d)、0.486g/(kg·10ml·d)、0.972g/(kg·10ml·d)]。其中，HG-M组是临床成人的等效剂量。每天1次，共计3个月。每组大鼠用标准饲料和饮用水喂养，称量体重并每周记录1次，根据体重增加给药剂量。各组大鼠给药3个月后，用骨组织形态计量学的方法测量，与Sham组比较，OVX组大鼠的松质骨骨量减少，骨结构变差，动态参数分析表明骨形成率增加，成骨细胞和破骨细胞数增加，呈骨高转换，提示实验造模成功[8]。

在药物干预结束时，用2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，用注射器抽取右心室的血液，分别取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和胸腺。主要脏器去除多余的脂肪和其它组织，并在相同条件下称重。记录数据后，按编号将组织置于10%的甲醛溶液固定24h，冲洗6h后，将一小部分心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和胸腺置于70%乙醇进行组织脱水，然后用包埋机包埋在石蜡中。用切片机将主要脏器组织切出4μm薄片，用苏木素-伊红染液对切片染色，切片烘干后用显微镜观察拍片。

2 结果与分析

2.1护骨胶囊对大鼠主要脏器重量的影响使用护骨胶囊3个月后，OVX组脾脏重量与Sham组相比显著增加(P<0.01)，胸腺重量明显下降(P<0.05)；与OVX组相比，HG-L组胸腺和HG-M组脾脏重量明显增加(P<0.05)，其它组变化无统计学差异；与HG-L组相比，HG-H组的胸腺重量明显下降；与HG-M组相比，HG-H组的脾脏重量明显下降。见表1。

表1 应用护骨胶囊对SD大鼠器官重量的影响

注：与Sham组比较，*P<0.05，**P<0.01；与OVX组比较，#P<0.05，##P<0.01；与HG-L组比较，□P<0.05，□□P<0.01；与HG-M组比较，◇P<0.05，◇◇P<0.01

2.2护骨胶囊对大鼠心、肝、肺、肾、胸腺和脾脏组织形态的影响

2.2.1 心脏的组织形态变化 药物组使用3个月对心脏组织形态的影响主要是细胞轻度水肿。Sham组的心肌细胞有横纹，呈短圆柱形状，有分支，并且核的形状像椭圆形或矩形。与Sham组比较，OVX组心脏无明显变化；与OVX组相比，HG-L、HG-M和HG-H组心肌细胞略有水肿，无其它病理改变。见图1。

图1 各组对大鼠心脏的影响(4um×10)

2.2.2 肝脏的组织形态变化 卵巢切除组和药物组使用3个月对肝脏无明显影响。Sham组肝细胞呈脐带状，多角形，有肝小叶结构，门静脉区无扩大，没有炎症反应，肝板排列整齐。与Sham组比较，OVX组肝脏无明显变化；与OVX组相比，HG-L、HG-M和HG-H的肝脏没有显著变化。见图2。

图2 各组对大鼠肝脏的影响(4um×10)

2.2.3 脾脏的组织形态变化 卵巢切除组和药物组使用3个月对脾脏无明显的影响。Sham组有一定数量的淋巴结，脾窦内含有少量的铁血黄素。与Sham组比较，OVX组脾脏无明显变化；与OVX组比较，HG-L、HG-M和HG-H组脾脏无明显变化。见图3。

图3 各组对大鼠脾脏的影响(4um×10)

2.2.4 肺的组织形态变化 卵巢切除组和药物组使用3个月对肺的影响主要是细胞水肿和静脉瘀血。Sham组的肺泡细胞呈立方形或圆形，肺静脉富含血液。与Sham组相比，OVX组肺泡细胞出现轻度水肿和肺静脉充血；与OVX组比较，HG-L、HG-M和HG-H组肺无明显变化，见图4。

图4 各组对大鼠肺脏的影响(4um×10)

2.2.5 肾脏的组织形态变化 卵巢切除组和药物组使用3个月对肾脏无明显影响。Sham组的肾小管细胞是单层立方上皮细胞，肾小球系膜胞体呈梭形或不规则星形和三角形。与Sham组相比，OVX组肾小管细胞无明显变化；与OVX组相比，HG-L、HG-M和HG-H组肾小管细胞无明显变化。见图5。

图5 各组对大鼠肾脏的影响(4um×10)

2.2.6 胸腺的组织形态变化 卵巢切除组和药物组使用3个月对胸腺无明显影响。Sham组胸腺的胸腺囊较薄，皮质较厚，皮质和髓质明确，皮质内淋巴细胞密集，偶见凋亡细胞或凋亡小体。在髓质中可以看到由上皮细胞组成的更多胸腺体。与Sham组比较，OVX组胸腺无明显变化；与OVX组比较，HG-L、HG-M和HG-H组胸腺无明显变化。见图6。

图6 各组对大鼠胸腺的影响(4um×10)

3 讨论

在现有文献中，中成药对去势大鼠影响的研究主要集中在骨骼方面，目前对其主要脏器的报道并不多见，但有糖皮质激素对大鼠软组织和免疫系统的研究[12]。本研究旨在探讨护骨胶囊对SD大鼠主要脏器的影响，为药物的安全性提供实验依据。

结果显示，卵巢切除组脾脏重量与假手术组相比显著增加，而胸腺重量明显下降；与卵巢切除组相比，护骨胶囊中剂量组脾脏和护骨胶囊低剂量组胸腺重量明显增加。脾脏和胸腺都是机体最重要的免疫器官，在免疫功能调控中担任重要角色。脾脏、胸腺重量是代表脾脏和胸腺大部分形态的重要指标，而形态结构可以大致反映器官的功能状态。卵巢切除后脾脏重量增加，这和玫参颗粒对围绝经期大鼠内分泌-免疫功能的影响中去卵巢后大鼠免疫器官脾脏系数降低的研究结果不符[13]，和张婷婷等[14]关于雌激素预防性给药对去卵巢大鼠骨和脏器的影响中所得出的摘除大鼠卵巢会导致脾脏指数增加的研究结果相符，具体原因不明，有待深入研究。而胸腺重量明显下降，这与衰老动物模型可导致大鼠脾脏和胸腺结构与功能损伤，重量和指数都是降低的研究结果相符[15-16]。

相对OVX组，HG-M组治疗后，脾脏重量明显增加，HG-L组治疗后，胸腺重量明显增加，接近Sham组，HG-H组治疗后，脾脏和胸腺无明显变化。结果提示护骨胶囊中剂量和低剂量可能对脾脏和胸腺这两大免疫器官有调节作用，推测原因是护骨胶囊组方中含有当归，而当归多糖在延缓大鼠的免疫系统衰老或损伤的机制中有一定的作用[14]，且护骨胶囊组方中的淫羊藿、制何首乌、熟地黄、龟甲、山药和杜仲都有提高免疫功能的现代药理学研究。护骨胶囊低、中、高剂量治疗后，基本改变为心肌细胞轻度水肿，给药组心肌细胞略有水肿、卵巢切除组的肺泡细胞出现轻度水肿和肺静脉充血，其它脏器的组织形态学没有发生明显的病理改变。给药组与卵巢切除组比较无明显变化，表明护骨胶囊对骨质疏松大鼠主要脏器没有损伤。

综上所述，本研究以去势SD雌性大鼠主要脏器为考察对象，探究复方中药护骨胶囊作用下主要脏器的影响。结果表明，护骨胶囊中剂量和低剂量治疗后，脾脏和胸腺重量明显增加，提示可能对脾脏和胸腺这两大免疫器官有调节作用，推测是护骨胶囊组方中含有淫羊藿、制何首乌、熟地黄、龟甲、山药和杜仲，这些药材对免疫器官有影响。而HG-H组对这两个脏器无明显影响。去势大鼠主要脏器的组织形态在灌服护骨胶囊低、中、高剂量3个月后未有明显的病理变化，提示护骨胶囊的临床用药安全性。研究仅涉及到护骨胶囊对主要脏器重量和组织形态结构的影响，没有涉及软组织的指数，且尚未深入到对软组织细胞学和相关蛋白组织的研究，还不够全面，有待深入研究。本研究能为临床应用护骨胶囊提供安全性的证据，为骨质疏松症的防治开拓更安全有效的药物提供更多选择。