徐伟军 潘辉 陈西佳 赵褀

碳青霉烯类抗生素因其抗菌谱广、抗菌活性强、对ESBLs稳定及毒性低等优点，一直作为ESBLs菌株严重感染患者的首要选择，曾被称为临床治疗阴性菌所致严重感染的“最后一道防线”［1］。但近些年随着碳青霉烯类抗生素在临床的广泛使用，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的报道越来越多［2］。其中KPC型碳青霉烯酶于2001年美国首先报道在肺炎克雷伯菌中发现的一种丝氨酸酶［3］，能够水解亚胺培南、美罗培南和头孢菌素等多种临床常用一线抗菌药物，从而导致细菌多重耐药，对人类健康造成了严重的威胁。有研究显示［4］，KPC基因位于质粒上，易在同一菌种不同菌株甚至不同菌种之间移动，造成局部暴发甚至世界范围内的扩散。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）在巴西、中国台湾、日本、古巴等多个地区均有分离［5-8］。本研究对本院临床标本中CRKP的药物敏感性进行分析，以了解其耐药机制和流行特征。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 分离本院2017年1月至2018年6月临床标本中CRKP共189株。126株分离自痰液，23株分离自分泌物，20株分离自尿液，13株分离自全血，1株分离自脑脊液，6株分离自导管尖端。

1.2 试剂和仪器 Vitek 2 Compact 全自动细菌鉴定仪（法国bioMérieux公司），PCR扩增仪、Rotaphor System 6.0 脉冲场凝胶电泳仪、UVIBand PFGE 图像分析软件及紫外成像系统（德国Biometra公司），细菌多点接种仪（日本Oriental Motor公司），Taq酶及PCR相关试剂（日本TaKaRa），亚胺培南、美罗培南、厄他培南纸片（英国Oxoid公司），琼脂糖电泳仪。

1.3 菌株鉴定及药敏试验 分离的细菌由Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定仪进行菌种鉴定及药敏试验。碳青霉烯类抗生素药敏采用琼脂稀释法测定其最低抑菌浓度（MIC）。根据美国临床和实验室标准化协会（CLSI，2016）的解释标准判断药敏试验结果。

1.4 细菌耐药基因PCR扩增及序列分析 细菌基因组DNA提取：根据产品说明书，通过水浴裂解、去蛋白、异丙醇沉淀和洗脱等步骤完成基因组DNA快速抽提。PCR反应体系为：引物各10pmol，含MgCl2的 dNTP8μl，10×Buffer 2 5μl，Taq 酶 0.5μl，0.1μg基因组DNA，无菌纯水补足至50μl。PCR反应条件为：94℃ 4min，1个循环；94℃ 1min，退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃充分延伸5min，1个循环。PCR产物在含EB的1.0%琼脂糖凝胶上100V恒压电泳30min，紫外灯下观察结果。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。所得DNA序列与GenBank中的数据库进行比对，确定耐药基因型。耐药基因的引物序列、扩增长度等相关信息见表1。

表1 耐药基因PCR扩增所用序列

2 结果

2.1 CRKP药敏结果 本研究共分离到CRKP 189株，对亚胺培南耐药或中介耐药（MIC：2～128mg/L），对美罗培南和厄他培南均为耐药（MIC：4～128mg/L）。CRKP对头孢菌素、氨曲南、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、和左氧氟沙星呈高水平耐药，对多粘菌素E、替加环素敏感性较高（见表2）。

表2 肺炎克雷伯菌药物敏感试验结果（%）

2.2 耐药基因检测结果 189株肺炎克雷伯菌均产KPC-2型碳青霉烯酶，未检出NDM与IMP型金属β-内酰胺酶，其中5株同时产VIM-1型金属β-内酰胺酶，blaCTX-M-9、blaTEM、blaSHV检出率均＞60%。见表3。

表3 耐药基因检测结果分析

2.3 染色体DNA同源性分析 应用UVIBand软件对PFGE条带进行分析显示，共有2种分型（a型、b型），其中a型较多，占67.9%。（见图1）。

3 讨论

图1 肺炎克雷伯菌染色体D N A脉冲场凝胶电泳（PFGE）结果

临床研究显示，大部分产blaKPC肺炎克雷伯菌分离自入住ICU 病房、患有心脑血管疾病的老年患者，提示这类患者是感染或携带产KPC-2肺炎克雷伯菌的高危人群［9］。本研究收集到携带CRKP的患者中106例来自ICU，20例来自脑外科，33例来自呼吸内科，患者的平均年龄为67岁，＞50岁者占82%。符合这些条件的患者基础疾病较多，免疫力低下，时常需要静脉置管、气管插管等侵入性操作，进一步增加了感染的可能［10］。

从药物敏感试验发现，189株CRKP对除多粘菌素E和替加环素以外的其他抗生素表现出较高的耐药性。但有部分菌株对亚胺培南和美罗培南为中介耐药，甚至有些菌株处于敏感范围，因而极易导致这类菌株被漏检，容易误导临床的抗菌药物选择，造成院内感染的隐性传播。而且这些菌株常同时产其他β-内酰胺酶，从而对多种抗菌药物耐药，给临床治疗带来了一定的困难，临床应及时选择相应药物进行治疗［11-12］。

肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制包括产碳青霉烯酶、ESBLs、AmpC酶过度表达伴外膜蛋白缺失或数量减少［13-14］、青霉素结合蛋白亲和力的改变［15］、主动外排泵活跃等，其中产碳青霉烯酶是最常见的耐药机制，包括A类、B类、D类碳青霉烯酶，其中KPC-2型碳青霉烯酶最多见［16-17］。自2001年美国报道首例产KPC-2肺炎克雷伯菌以来，产KPC菌株迅速向其他国家播散。在中国，浙江学者于2007年首次报道了产KPC-2酶肺炎克雷伯菌，此后在全国各地陆续也有报道，但暴发流行以经济发达省市多见。本研究收集本院189株CRKP，基因扩增显示均为产KPC-2肺炎克雷伯菌，还有5株同时产VIM-1。VIM金属β-内酰胺酶是一种能水解几乎所有（除氨曲南等单环外）的β-内酰胺类抗生素，也是已报道金属酶中与新德里金属β-内酰胺酶（NDM-1）序列相似性最高的一类获得性金属β-内酰胺酶，其基因位于整合子上，可造成不同种细菌间的水平传播和扩散［18］，需要引起注意。

综上所述，本院有可能发生过一次产blaKPC-2肺炎克雷伯菌的传播流行，从而导致分离的CRKP均产KPC-2碳青霉烯酶。因此预防控制医院感染非常重要，如早期监测、加强临床抗菌药物的管理、加强医院消毒灭菌的监督管理、加强医务人员手的清洁与消毒、加强医源性传播因素的监测与管理、对易感人群实行保护性隔离、及时总结与反馈临床上分离的病原体及其对抗菌药物的敏感性、开展医院感染的宣传教育等。