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参黄膏外敷兔神阙穴对小肠吻合口愈合的影响

2019-07-30叶国梅史亚楠王蓉芸孙秋华徐小宏

浙江临床医学 2019年6期
关键词:神阙穴胶原蛋白课题组

叶国梅 史亚楠 王蓉芸 孙秋华 徐小宏*

近年来,胃肠道吻合口瘘越来越受到临床医生的重视,据报道食管和直肠手术吻合口瘘发生率约10%~15%,而其他部位消化道发生率约5%~10%[1],特别是胃肠道肿瘤术后常因吻合口瘘而延迟术后辅助放化疗而增加复发和远处转移的风险[2]。传统经胃肠道给药或静脉给药促进吻合口愈合有增加胃肠道负担或增加补液量的弊端。课题组前期研究表明,基于中医外治理论参黄膏外敷神阙穴可减轻术后肠道功能障碍(Postoperative ileus,POI)模型大鼠的小肠平滑肌层炎症反应,并促进胃肠道传输。本文进一步探讨参黄膏外敷兔神阙穴对胃肠吻合口愈合的影响,为临床促进吻合口愈合提供新的思路和治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料 (1)实验动物:24只雄性新西兰兔,由浙江中医药大学动物中心提供,合格证号:SCXK(苏)2015-0003,体质量为2.5~3.0kg。(2)参黄膏制备:按课题组前期研究的参黄膏制剂配方(人参、丹参、大黄、枳实、厚朴、丁香、吴茱萸等药组成)制备工艺与方法,通过单因素试验、正交试验,以质量标志物的转移率与纯度为主要指标,确定了参黄方提取纯化工艺,以外观性状、初黏力、持黏力,质量标志物的释放度等为指标,进行质量把关,由本院制剂室制作用于动物实验[3]。(3)试剂和仪器:羟脯氨酸试剂盒(R&D公司);Masson三色染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);YAP/TAZ 抗体(Cell signaling公司);TGF-β1抗体(Santa Cruz公司);医用5-0 VICRYL可吸收线(Ethicon公司);实验室连续传输注射泵LSP01-1C(Longer公司);YB-150A型精密压力表(温州正泰仪器仪表有限责任公司);Olympus BX53光学显微镜。

1.2 实验方法 (1)造模与给药:新西兰兔适应环境1周,术前24h禁食,自由饮水,采用随机排列表法将24只兔编号随机均分为对照组和参黄膏组。两组均异氟烷吸入麻醉,常规消毒后取腹部正中切口长约5cm,打开腹腔,距回盲部15cm切除约2cm小肠,5-0 VICRYL可吸收线端端间断吻合,并关闭肠系膜,1号丝线逐层关闭腹腔。参黄膏组术后取参黄膏贴,滴数滴透皮剂至药膏,均匀浸透后帖敷于兔神阙穴;对照组使用等量透皮剂滴入细沙包外敷。术后自由进食饮水;手术操作均由同一人完成。各组膏贴或细沙包每天更换2次。(2)观察指标:术后3d和7d实验兔再次吸入麻醉下剖腹探查取样后处死。如吻合口周围发现脓苔及坏死组织或明显漏口者可诊断为吻合口瘘。分别测定吻合口破裂压、吻合口羟脯氨酸水平、吻合口YAP、ZAT和TGF-β1蛋白表达。①吻合口破裂压力测定:参考文献[4],分离腹腔粘连,距离吻合口近、远端各3cm分别切断肠袢并置于PBS液中,近端连接YB-150A型压力计,另一端接连续传输注射泵,以6ml/min的速率注入亚甲蓝溶液,至吻合口破裂亚甲蓝溢出为止,压力计所显示最高压力点为吻合口破裂压值(单位mmHg)。②吻合口组织羟脯氨酸水平测定:切除约0.5cm宽吻合口组织,4℃PBS洗净后保存于-80℃冰箱,以高效液相色谱法检测羟脯氨酸水平[5]。③吻合口组织胶原纤维含量测定:吻合口组织甲醛固定后行Masson染色,用VIDHS图像分析软件计算同一视野下胶原纤维总面积与场面积之比表示胶原纤维的面积密度值。④Westblot法测吻合口YAP、ZAT和TGF-β1蛋白表达:术后7d切除吻合口,4℃PBS液清洗后显微镜下清理线结,冰浴上将组织剪碎,RIPA裂解液裂解匀浆并超声破碎,4℃ 13000r/min离心15min,取上清液,Bradford法定量测蛋白浓度,8%SDS-PAGE凝胶电泳分离目的蛋白,65V×2h转膜,5%脱脂奶粉封闭1h,分别加YAP/TAZ 抗体(1∶1000)和TGF-β1抗体(1∶1000)孵育4℃过夜,含吐温PBST液洗脱一抗,加AP标记的二抗(兔抗羊,1∶1000)孵育1h,洗脱二抗后滴加显影液显色,化学发光后压片,以β-actin作为内参照。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以(x±s)表示,组间均数比较采用单因素方差分析,方差齐时采用t检验,方差不齐时采用校正t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组吻合口破裂压力比较 见表1。

表1 两组家兔吻合口破裂压力比较[P/mmHg,(x±s)]

2.2 两组吻合口羟脯氨酸水平比较 见表2。

表2 两组家兔吻合口羟脯氨酸水平比较[Mb/(μmol·g),(x±s)]

2.3 两组吻合口胶原蛋白比较 见表3。

2.4 两组吻合口YAP、ZAT和TGF-β1蛋白表达比较 术后第7天westblot法显示两组吻合口组织均有YAP、ZAT和TGF-β1蛋白阳性条带。与对照组比较,参黄膏组吻合口组织YAP、ZAT和TGF-β1蛋白表达明显增加。见图1。

图1 两组术后7天吻合口YAP、ZAT和TGF-β1蛋白表达

3 讨论

胃肠道术后并发吻合口瘘除延长住院时间和增加医疗费用外,常继发严重水电解质紊乱、营养不良甚至感染性休克和多脏器功能衰竭,临床处理非常棘手。据统计结直肠癌术后吻合口瘘围手术期病死率高达6%~22%,且与远期肿瘤局部复发有相关性[6]。吻合口愈合过程受多种因素影响,如吻合口血供、张力、感染、远端梗阻以及伴随疾病等。吻合口瘘的病因处理是关键,但是促进吻合口组织愈合也是预防吻合口瘘的重要环节。传统抗炎补液及胃肠减压等手段预防吻合口瘘效果并不明显。

研究显示[7],采用人参、大黄等药制成参黄散贴敷治疗POI,临床疗效显著,可促进胃癌术后POI的早期康复,可能的作用机制是降低POI兔小肠平滑肌层ICAM-1、IL-6、iNOSmRNA表达和促进IL-10的mRNA表达,促进Ghrelin分泌和增加小肠平滑肌GHS-R1a表达,而改善POI兔胃肠道传输[8-9]。而神阙穴皮肤解剖上无脂肪组织,角质层薄,与腹膜直接相连;脐下腹膜有丰富的静脉网,药物在脐渗透后,直接扩散至静脉网而进入体循环。课题组前期研究表明参黄膏经神阙穴给药渗透力强,吸收快,还可避免“首过效应”。临床实践表明经外敷神阙穴给药途经优势独特,可避免静脉输注和经胃肠道用药,对于需限制补液量和胃肠道手术患者尤为有益,而且方法简便、患者依从性好、易于推广应用。为此,课题组研制成参黄膏剂型,以新西兰兔为研究对象探索参黄膏外敷神阙穴对胃肠吻合口愈合过程的影响。吻合口破裂压可准确地描述吻合的机械强度,其主要与吻合处胶原沉积量有关。羟脯氨酸几乎只存在于胶原蛋白中,可作为评估胶原蛋白代谢的有效指标[10]。实验结果表明参黄膏外敷可提高吻合口破裂压力,促进吻合口胶原沉积和提高羟脯氨酸水平,可显著促进吻合口愈合。

随后,课题组进一步研究参黄膏外敷神阙穴促进吻合口愈合可能的机制。Hippo信号通路参与调控组织再生、机械力传导和干细胞更新与分化等多个生物学过程[11]。Yes 相关蛋白(YAP)和转录共激活因子PDZ结合基序(TAZ)为Hippo信号通路的下游级联效应分子。当Hippo信号通路受到抑制时,YAP/TAZ不被磷酸化而进入细胞核,与其他转录因子结合,介导TGF-β1通路中Smad-2、p21和Smad-7蛋白的表达[12]。如YAP/TAZ被磷酸化而裂解,降低转化生长因子(TGF-β1)表达,延缓创口愈合。TGF-β1与成肌纤维细胞和血管平滑肌细胞的分化有关,介导胶原蛋白的合成和修复,也与创口收缩有关。smad-2密切参与伤口愈合过程,在体内伤口愈合过程中依赖于TGF-β1信号。胶原蛋白降解一般术后24h达到高峰,术后第7天胶原蛋白合成抑制了胶原蛋白的降解,吻合口愈合反应胶原合成与裂解之间平衡。本实验结果表明,术后7dYAP、ZAT和TGF-β1蛋白在两组吻合口均有表达,但与对照组比较参黄膏组蛋白表达均明显增加。说明Hippo信号通路在参黄膏外敷神阙穴可促进胃肠吻合口愈合方面发挥重要作用。

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