高振杰，郭锡钦

（1.北京大学附属中学，北京 100081；2.浙江农林大学动物科技学院，浙江 临安 311300）

大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌作为畜禽养殖中常见的致病菌，发病率较高，且能通过各种方式造成食品污染。其中大肠杆菌主要引起仔猪黄白痢，沙门氏菌引起仔猪副伤寒、鸡白痢和禽伤寒等[1-2]。金黄色葡萄球菌常引起仔猪渗出性皮炎、牛羊乳房炎和子宫内膜炎、犬猫鼻炎以及鸡水肿病等多种动物疾病[3-5]。为预防和治疗这3种细菌，养殖过程中大量不合理使用抗生素产生了许多耐药菌株，已威胁到人类的健康，故寻找可抑制这些细菌生长的绿色饲料添加剂具有重要意义。

α-单月桂酸甘油酯（GML），又名十二酸单甘油酯，是可由月桂酸和甘油直接酯化得到的中链脂肪酸，也是一种亲酯性非离子型表面活性剂。研究表明，GML 具有抑菌、抗病毒作用，且被美国FDA（食品与药物管理局）认定为GRAS（一般公认安全）类食品添加剂。我国卫生部也于2005 年4月批准GML用于各类食品[6-8]。

研究表明，GML 可提高动物的生产性能以及免疫机能[9-10]。但是关于其抑制肠道致病菌方面的报道并不多。本试验选取了大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌这3 种畜禽养殖中常见致病菌，通过牛津杯抑菌实验和摇瓶实验，探究一定浓度的GML 对这3 种菌的抑菌效果，为进一步合理利用GML提供一定的数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验样品与菌种

GML 原料购自浙江惠嘉生物科技股份有限公司；大肠杆菌K88由浙江大学惠赠；鸡白痢沙门氏菌（CVCC1791）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）购自中国普通微生物菌种保藏中心。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

GML溶液的配制：准确称取GML样品2 g，用95%乙醇溶解成澄清溶液，定容至50 mL 容量瓶中，终浓度为40 mg·mL-1。

LB 液体培养基的配制：准确称取胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，用ddH2O 定容至950 mL，用HCL 和NaOH 调 节pH 至7.0，再 用ddH2O定容至1 L，121 ℃灭菌30 min备用。

LB 固体培养基的配制：准确称取并加入LB 液体培养基的原料，再添加15 g 琼脂粉，调pH 至7.0，定容灭菌备用。

菌种活化及菌液制备：分别将大肠杆菌k88、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌接种在LB 固体培养基上，于37 ℃生化培养箱中培养16 h，挑取活化的细菌菌落，LB 固体培养基划线培养24 h，用无菌水将菌落洗脱，充分振荡，采用平板菌落计数法测定细菌数量，再制成1×106～1×107cfu·mL-1的悬浮液备用。

1.2.2 不同浓度的GML 对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌实验方法

将40 mg·mL-1浓度的GML 溶液依次配比稀释得到浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.0195 mg·mL-1的样本液，并以95%乙醇溶液作为阴性对照。

牛津杯双层平板扩散实验：LB 固体培养基于121 ℃高压灭菌30 min，冷却至适当的温度，无菌条件下向已灭菌的培养皿（90 mm）加入LB 培养基15～20 mL进行封底，待第1层培养基充分冷却凝固后，分别用灭菌移液器吸取已调好的供试菌0.1 mL（浓度106cfu·mL-1），将菌液接种至约45 ℃的LB 固体培养基，摇匀后迅速用移液管移取5～7 mL 含菌液的培养基至已凝固LB 培养基表面，并使菌液分布均匀。待第二层培养基完全冷却凝固后，用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯（φ6×8×10 mm）置于LB 培养基表面，加入适当量的样品溶液，使液面高度与杯口持平。培养皿盖上陶瓷盖后放入37 ℃恒温培养箱培养16～20 h。

使用菌落分析仪查看并测量每个培养皿中抑菌圈直径的大小，根据抑菌圈直径的判定标准进行敏感程度判定：抑菌圈直径＞20 mm 为极度敏感，直径15～20 mm为高度敏感；直径10～15 mm为中度敏感；直径7～9 mm 为低度敏感；抑菌圈直径＜7 mm为不敏感；直径越大，抑菌能力越强[11]。

1.2.3 GML 处理不同时间对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌生长抑制的试验方法

配制LB 液体培养基500 mL，分装至100 mL 锥形瓶中，每瓶50 mL，共分装9瓶，灭菌冷却备用。

接种之前，在超净台将培养瓶分为3 组，每组3个重复，组1为空白对照组，不添加任何菌与GML；组2为试验组，接种适宜浓度（1×106cfu·mL-1）的菌液并添加GML 原料（终浓度为1 mg·mL-1）；组3 为对照组，只接菌不添加GML。加样后用锡纸封盖以防止污染。37 ℃，180 r·min-1于摇床上震荡摇瓶，在培养时间为0、4、8、12、24 h 时取培养液1 mL，于96 孔板加样200 μL·孔-1，每份样3 个重复，采用酶标仪在600 nm 波长处检测OD 值。OD值越高，说明培养液越浑浊，菌的数量越多。

1.3 统计分析

试验数据用SPSS 21.0 进行单因素方差（One-Way ANOVA）分析，使用LDS 法进行多重比较，结果以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 不同浓度GML 对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的影响

不同浓度GML 对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用见附表。

由附表可知，大肠杆菌对GML浓度≤40 mg·mL-1低度敏感，抑菌圈直径与溶剂对照组相比无显著差异；沙门氏菌对GML 浓度＜0.156 mg·mL-1低度敏感，对GML 浓度≥0.156 mg·mL-1中度敏感，GML浓度≥0.313 mg·mL-1抑菌圈直径显著＞0.156 mg·mL-1及以及下浓度GML 的抑菌圈直径；金黄色葡萄球菌对GML 浓度≤0.039 mg·mL-1低度敏感，GML浓度≥0.078 mg·mL-1中度敏感，GML 浓度≥2.5 mg·mL-1高度敏感。

附表 不同浓度GML对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用

2.2 GML处理时间对大肠杆菌生长的抑制效果

GML 处理不同时间对大肠杆菌生长的抑制作用见图1。

图1 GML处理不同时间对大肠杆菌生长的抑制作用

由图1 可知，GML 对大肠杆菌无显著抑菌作用，CML 组和对照组培养液OD 值均随时间延长逐渐升高，在12 h后开始保持平稳。

2.3 GML 处理不同时间对沙门氏菌生长的抑制效果

GML 处理不同时间对沙门氏菌生长的抑制效果见图2。

由图2可知，沙门氏菌组对照组和GML组培养液OD 值在培养8 h 前皆稳定上升，在8 h 后两者的OD 值出现一定差异，12～48 h 时两者OD 值差异显著（P＜0.05），36～48 h 时OD 值趋于平缓。结果表明，GML 对沙门氏菌生长有抑制效果，且抑制效果从12 h开始较为明显。

图2 GML处理不同时间对沙门氏菌生长的抑制作用

2.4 GML 处理不同时间对金黄色葡萄球菌生长的抑制效果

GML 处理不同时间对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用见图3。

由图3 可知，金黄色葡萄球菌对照组的培养液OD 值在8 h 之前快速升高，在8 h 之后保持平稳增长；GML 组培养液OD 值在12 h 前无明显升高，在12 h之后平缓升高，从4 h开始两组间OD值表现为差异显著（P＜0.05）。结果表明，从4 h 开始，GML对金黄色葡萄球菌的生长有明显的抑制作用。

图3 GML处理不同时间对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用

3 讨 论

α-单月桂酸甘油酯作为中链脂肪酸，在食品中应用广泛。研究表明，月桂酸及其单甘油酯抑菌效果优于同类脂肪酸及其甘油酯[12]。其抑菌作用可通过与细菌细胞壁或生物膜结合影响其代谢，或是抑制芽孢类细菌的芽孢生长实现[13-14]。本试验结果表明，GML 对属于革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌有显著抑制效果；而对革兰氏阴性菌类的沙门氏菌有较强抑菌作用，但对大肠杆菌抑制效果相对偏弱，与前人研究结果基本一致[14]。试验结果表明，GML 在体外对大肠杆菌抑制效果较差，可能与大肠杆菌种类或与试验所用GML 浓度有关；GML 在金黄色葡萄球菌增殖前对其产生抑制作用，而对沙门氏菌的抑菌效果在12 h 后开始呈现差异，此现象或许与GML 跨越细胞膜的难易程度有关。由于芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的细胞壁多以肽聚糖和包括磷壁酸的酸性多糖构成，利于GML穿越细胞膜，通过破坏其信号转导系统，影响膜代谢等方式发挥抑菌效果，因此其在细菌生长之初就能发挥抑制效果。而针对革兰氏阴性菌，GML的抑菌效率相对较低，这可能与其膜表面的LPS脂多糖层有关。研究表明，革兰氏阴性菌如变形杆菌和大肠杆菌质膜的LPS被破坏后，GML对其抑制效率会显著提升，因此实际应用中常把GML 与LPS 干扰剂如EDTA 等制成凝胶混用以达到更好的抑菌效果[15]。

4 结 论

本试验结果表明，GML 浓度≤40 mg·mL-1对大肠杆菌无显著抑菌作用，≥0.156 mg·mL-1对沙门氏菌有抑制作用，≥0.078 mg·mL-1对金黄色葡萄球菌有抑制作用。1 mg·mL-1对金黄色葡萄球菌的抑制作用在培养4 h 出现，对沙门氏菌的抑制作用在培养12 h 出现，对大肠杆菌在培养48 h 内无抑制作用。综上所述，GML 对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，沙门氏菌次之，大肠杆菌几乎无作用。