李怀东，张兆瑞，陈良安

原发肺冲击伤（primary blast lung injury，BLI）是指爆炸时产生冲击波超压直接作用于胸部造成的肺损伤［1，2］。 BLI是导致急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的重要病因，病死率高［3］。 近年来，全氟化碳（perfluorocarbon，PFC）作为呼吸携氧介质治疗ARDS引发了液体通气研究的热潮。PFC以其携氧能力强、溶解和释放氧快（10毫秒内）等特点［4］，已经用于液体通气中雾化或汽化吸入治疗ARDS的实验研究，可能通过抑制中性粒细胞的活化和减少中性粒细胞在肺内的迁移和募集［5］、抑制巨噬细胞释放炎性分子［6］、抑制NF-κB的活化和抑制MAPK通路［7］等机制，从而提高动脉血氧分压，改善氧合、提高肺脏顺应性，减轻肺组织的炎症反应，有助于改善ARDS的预后和转归［7］。

microRNA（miRNA）是在真核生物中存在的一类内源性的具有调控功能的非编码小RNA分子（长度约22个核苷酸），在转录和转录后水平调控基因的表达［8］。miRNA通过与靶mRNA特异结合，抑制转录后基因表达，在细胞周期、生物体发育时序等方面起重要作用。miRNA在ARDS敏感性上起着潜在的关键作用，且在多种炎症性肺病中发挥着影响［9］。miRNA芯片技术是高通量研究miRNA的有效的手段，已经在肿瘤、心血管疾病等学科开展了分子机制的相关研究。该研究通过miRNA芯片筛选PFC作用BLI犬相关的miRNA及其靶基因，探讨汽化吸入PFC能否通过miRNA的表达来调控BLI相关基因的变化，为深入研究PFC的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料及仪器 小型冲击波发生器（北京理工大学爆炸科学与技术重点实验室）；PB7200呼吸机（美国Puritan-Bennett公司）；全氟辛烷（上海华捷视医疗设备有限公司）；FlashTag Biotin HSR RNA Labeling Kit（批号：20131127）；GeneChip○ R Hybridization （批号：20131216）；AMBION 动物试剂盒 （批号：20130523）；扫描仪、杂交炉、洗涤工作站、2100振荡器、NanoDrop、PCR仪 （美国Affymetrix公司）；离心机、浓缩仪（德国eppendorf公司）；金属浴-2、金属浴-3（杭州博日科技有限公司）。

1.1.2 实验动物 经解放军总医院伦理委员会（解放军总医院福利伦理审查批号：2012-D6-06）审核通过，该实验采用8～15月龄健康杂种犬18只（购自北京绿源伟业养殖场），雌雄不限，体重9.0～12.0 kg，平均（10.84±1.60）kg，由解放军总医院动物实验中心（实验动物使用许可证号：SYXK（军）2012-0062）室温饲养3 d。采用随机数字表法随机分为2组，每组9只。

1.2方 法

1.2.1 分组 犬称重后选取四肢浅静脉注射3%戊巴比妥钠（25～30 mg/kg）麻醉后绑缚四肢取仰卧位于手术台上固定。采用北京理工大学爆炸科学与技术重点实验室研制的小型冲击波发生器，按照实验流程制备肺冲击伤犬模型［10］。分为两组：单纯肺冲击伤组（BLI组，缩写为B组，n=9）：制作原发肺冲击伤模型成功后，观察7 h。肺冲击伤PFC汽化吸入通气组（BLI+MV+PFC 组，缩写为 BMP 组，n=9）：制作原发肺冲击伤模型成功后，在常规机械通气基础上（容量控制，呼吸频率（f）为 16 次/min；潮气量（Vt）为 10 ml/kg；吸呼比（I∶E）为 1∶1.5；吸入氧浓度（FiO2）为0.6；外源性呼气末正压（PEEP）为5 cmH2O；恒定流速波送气。调整好后至机械通气结束不改变呼吸机参数设定），经呼吸机吸气管路应用湿化罐装置加热（调整湿化器温度至48～50℃加热PFC）蒸发给予 PFC（10 ml/kg·h）连续汽化吸入治疗 2 h，然后继续常规机械通气5 h。实验犬处死后立即开胸解剖取出致伤肺叶眼科剪剪取约2.0 cm×1.0 cm×1.0 cm肺组织多块分装入冻存管中立即置入液氮罐中速冻保存备用。

1.2.2 样本处理 总RNA的提取：液氮罐中取出冻存的实验犬肺组织，眼科剪剪取10 mg肺组织，移入加入适量液氮的研钵中，快速用力研磨成匀浆，移入匀浆器中加入10倍体积的lysis/binding buffer（1 ml lysis/binding buffer/0.1 g 组织）彻底混匀。加入1/10体积的Homogenate additive，涡旋振荡器充分混匀，冰上放置10 min（以上操作在冰上）。加入与 lysis（不计 Homogenate additive）相同体积 的 acid-phenol：chloroform （300 μl lysis/300 μl acid-phenol：chloroform），涡旋混匀 30～60 s，室温10 000 g离心5 min。取上清置入一新管中，记录体积。加入1.25倍体积无水乙醇，涡旋振荡器充分混匀，反复过纯化柱，体积不超过 700 μl，10 000 g 离心 15 s。加入 350 μl wash 1，离心 5～10 s，清洗纯化柱，10 000 g 离心 15 s，弃过滤液。 DNase I 10 μl和Buffer RDD 70 μl加入膜上（QIAGEN#79254），20～30℃放置 15min。加入 350μl wash 1，离心 5～10s，清洗纯化柱，10000g离心15s，弃过滤液。加入500μl wash 2/3，离心 5～10 s，清洗纯化柱两次，10 000 g 离心15 s，弃过滤液，离心1 min。将离心柱放置到新的收集管中，柱中心加入 100 μl 95℃预热的Elution Solution或nuclease-free水，室温最高转速离心 20～30 s，收集管中液体即为提取的 Total RNA，继续实验或放置在-70℃冰箱中保存。样品总RNA利用NanoDrop ND-2100 （Thermo Scientific）定量，并应用Agilent 2100检测RNA的完整性。总RNA加尾、生物素标记、芯片杂交及洗脱、洗涤、染色和扫描等步骤，按照芯片标准流程进行。

1.2.3 图像采集与数据分析 采用Affymetrix Gene Chip Command Console 软件（version4.0，Affymetrix）处理原始图像，用Expression Console（version1.3.1，Affymetrix）读取原始数据并进行RMA标准化。再利用 Genespring软件 （version 12.5；Agilent Technologies）进行后续处理。标准化后的数据进行探针过滤，用于比较的每组样本中，至少有一组100%标记为“P”的探针留下进行后续分析。利用Fold Change检验的倍数变化值进行筛选差异miRNA，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0。

2 结果

2.1 样本质检报告取B组不同犬肺组织样品5个 （每个0.1 g）和BMP组不同犬肺组织样品5个（每个0.1 g），送上海欧易生物医学科技有限公司检测样本，结果见表1。

2.2 两组样本miRNA芯片标准化数据将B组和BMP组犬肺组织经miRNA芯片处理后的单荧光芯片的原始数据经过标准化处理，两组数据总体分布具有对称性，分布集中。项目总体评价为成功。见图1。

表1 RNA（包含miRNA）Agilent 2100法质检结果

图1 BMP-G vs.B-G信号杂交散点图

2.3 筛选差异表达的miRNA应用Affymetrix miRNA 4.0芯片筛选，共有20条miRNA表达上调，3条miRNA表达下调 （表2，表3）。推测这些miRNA可能与PFC的作用存在关联。

表2 差异miRNA的统计

表3 Affymetrix miRNA 4.0芯片筛选得到的差异miRNA列表

2.4miRNA芯片数据的基因功能富集分析miRNA序列数据为miRBase 20.0数据库，mRNA序列为犬的mRNA 3'UTR序列数据。对差异miRNA进行靶基因预测，靶基因共449个。统计每个GO条目中所包括的靶基因个数，并用统计检验的方法计算每个GO条目中靶基因功能富集的显著性。GO功能富集分析这些靶基因主要涉及分子功能（molecular function）、细胞组成（cellular component）、生物过程（biological process）等功能。 见图 2。

应用KEGG数据库对靶基因进行pathway分析，并且用统计检验的方法计算每个pathway条目中靶基因功能富集的显著性。Pathway功能富集分析这些靶基因主要与癌症信号通路、细胞焦点粘连通路、细胞因子受体间相互作用通路等有关。见图3。

3 讨论

miRNA通过与靶mRNA特异结合，在转录和转录后水平调控基因的表达［11］，在多种生理病理过程中发挥至关重要的作用。目前研究发现，miRNA与免疫反应［12］和炎症通路［13］有关，也与炎症性肺病密切相关［14］，尤其在动物模型实验上，miRNA表达改变与ARDS的病理生理进程和信号转导途径相关联，miRNA在ARDS敏感性上起着潜在的关键作用，已成为 ARDS新的治疗靶点［15］。研究表明，miR-150［13］、miR-16［16］、miR-127［17］、miR-494［18］参 与 了ARDS炎症过程。由miRNA引起的相关基因表达变化可能会影响到大量的后续基因的表达，继而对机体多种生物学过程产生影响。对ARDS相关miRNA靶基因进行调控干预可能是防治ARDS的新策略。

有研究［18］发现抑制miR-494表达可作为脓血症相关ARDS大鼠模型的治疗选择。

图2 差异miRNA的GO富集分析

图3 差异miRNA的KEGG pathway富集分析

miRNA芯片技术广泛应用于人类和动物生命科学的基础研究中，如鉴定生长、分化、细胞凋亡、信号转导及鉴定疾病相关基因等。该研究采用Affymetrix基因芯片技术筛选PFC作用BLI犬相关的miRNA。结果筛选到23条差异表达的miRNA及预测的靶基因449个，在基因Gene Ontology数据库和KEGG PATHWAY数据库进行差异miRNA的GO富集分析和pathway富集分析，涉及相关的功能和通路，可能是PFC作用BLI犬相关的miRNA及其靶基因。通过差异基因的GO富集分析，可以寻找PFC作用BLI犬肺组织相关的靶基因可能和哪些基因功能的改变有关。GO富集分析预测靶基因共449个，主要涉及分子功能、细胞组成、生物过程等功能。Pathway富集分析可以寻找PFC作用BLI犬肺组织的差异基因可能和哪些细胞通路的改变有关。Pathway富集分析这些靶基因主要与癌症信号通路、细胞焦点粘连通路、细胞因子受体间相互作用通路等有关。pathway富集分析的PFC作用BLI犬相关的miRNA23条，进而影响靶基因的转录表达，为进一步后期蛋白质功能实验［如蛋白质印记（Western blot）、酶联免疫吸附试验（ELISA），免疫组化 （IHC）， 过表达 （over expression），RNA 干扰（RNAi），基 因 敲 除 （knockout），转 基 因 （transgene）等］的支持、验证和探讨提供了数据资料，也为深入理解和研究PFC对基因表达的影响提供了分子水平的理论依据。miRNA调控基因的表达非常复杂，在不同疾病、不同组织、不同生理病理阶段都不相同，而且一个miRNA标靶许多的基因。因此，基因芯片筛选是为后续的研究提供线索和方向，明确作用机制还距离甚远。将来需要进一步对筛选获得的miRNA进行QRT-PCR验证和靶基因预测，以完善和加强对miRNA在BLI中的作用及PFC可能的分子调控机制。该实验提示，全氟化碳汽化吸入可能通过影响肺冲击伤犬肺组织相关miRNA及其靶基因的表达发挥生物学作用。