孙志杰，许永亮，刘凌志，付楚溪，熊向华，毕秀丽，张惟材

1.辽宁大学 生命科学院，辽宁 沈阳 110036；2.军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071；3.沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院，辽宁 沈阳 110016；4.沈阳师范大学，辽宁 沈阳 110034

突触小体相关蛋白25（synaptosomal associated protein 25，SNAP25），是可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体蛋白（SNARE）复合物的组成部分之一[1]，它通过形成一个将突触囊泡和突触前膜结合在一起的紧密复合物使二者发生融合[2]，同时驱动神经递质释放过程中的胞吐作用，促进神经递质乙酰胆碱的释放[3]。

肉毒杆菌神经毒素（botulinum neurotoxins，BoNT）简称肉毒毒素，由厌氧的肉毒杆菌产生，是目前发现的毒性最强的蛋白毒素[4]。根据毒性的不同，可将肉毒毒素分为A～G共7种血清型。肉毒毒素由一条重链和一条轻链通过二硫键连接构成[5]。轻链是一种将Zn2+作为辅助因子的金属蛋白酶，可以特异性地切割SNARE复合物中的SNAP25蛋白，使突触囊泡无法与突触前膜融合，抑制神经元释放神经递质乙酰胆碱，从而引发肌肉弛缓性麻痹，严重的肉毒中毒还可导致人畜死亡[6]。由于SNAP25是肉毒毒素轻链切割的底物，制备针对SNAP25的单克隆抗体，可以作为检测抗体用于肉毒毒素活性的检测。

本研究中我们表达并纯化了SNAP25蛋白，将其作为免疫原免疫小鼠，利用杂交瘤技术制备鼠单抗。经过2轮筛选获得12株阳性杂交瘤细胞株，经鉴定选择14号杂交瘤细胞株进行抗体的大量制备，纯化后获得高纯度的单克隆抗体。

1 材料与方法

1.1 材料

6～8周龄BALB/c小鼠购自军事医学研究院实验动物中心；骨髓瘤Sp2/0细胞由本实验室保存；大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司；pET30a-SNAP25质粒由本实验室构建；弗氏完全、不完全佐剂，TMB显色液购自Sigma公司；DMEM购自Cellmax公司；HAT、胎牛血清购自Gibco公司；PEG1500购自Roche公司；Ni2+-IDA HP、HiTrap Protein G HP购自GE公司；HRP标记羊抗鼠IgG二抗购自Thermo公司；抗体亚型鉴定试剂盒购自北京博奥龙免疫技术公司；96孔酶标板购自NEST公司。

1.2 制备抗原SNAP25

将构建的重组质粒pET30a-SNAP25转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养；挑取平板上的单克隆接种至5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200 r/min振荡培养过夜；次日按1∶100接种至200 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200 r/min培养至D600nm为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，15℃、200 r/min振荡培养16 h，诱导重组蛋白表达；4℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清，菌体沉淀用结合缓冲液（20 mmol/L PB，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪 唑 ，1% TritonX-100，2mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF，pH7.2）重悬，超声波破碎菌体；4℃、12 000 r/min离心10 min收集上清，上样至已用结合缓冲液平衡过的Ni2+-IDA亲和层析柱，再用含不同浓度咪唑的洗脱缓冲液洗脱目标蛋白，收集各阶段的洗脱组分进行SDS-PAGE分析。

1.3 小鼠免疫及效价检测

选取4只SPF级6～8周龄雌性BALB/c小鼠，编号1～4。初次免疫每只小鼠经皮下注射60 μg SNAP25蛋白。具体地，将240 μg SNAP25蛋白用PBS稀释后加入等体积弗氏完全佐剂，充分混匀直至形成稳定的油包水型乳剂，在每只小鼠背部选取5个点进行皮下注射，0.2 mL/点；之后每隔2周重复免疫1次（佐剂换为弗氏不完全佐剂），共4次，免疫量为30 μg蛋白/只；第4次免疫7 d后对小鼠进行眼眶取血，全血于室温静置30 min，4℃、3000 r/min离心10 min收集血清，间接ELISA法测定血清效价。具体地，用2 μg/mL的SNAP25抗原包被96孔酶标板，100 μL/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次；用2%脱脂牛奶于37℃封闭2 h，PBS-T洗3次；血清用封闭液按1∶200稀释作为起始浓度，再按照1∶2梯度稀释共10个浓度，分别取100 μL加入96孔酶标板，37℃孵育1 h，PBS-T洗3次；HRP标记羊抗鼠IgG二抗按1∶50 000稀释，取100 μL加入96孔酶标板，37℃孵育1 h，PBS-T洗3次；每孔加入100 μL TMB显色液，避光显色5 min，加入终止液，酶标仪读数。

1.4 细胞融合

对血清效价最高的小鼠通过腹腔注射200 μg SNAP25蛋白进行抗原冲击，3 d后进行细胞融合。融合当天，将小鼠摘眼球取血（制备血清留作阳性对照）后断颈处死，在75%酒精中浸泡5 min；无菌条件下分离小鼠脾脏和胸腺，先将胸腺用注射器内芯研碎后加入1 mL HAT，转移至50 mL无菌离心管，放入培养箱备用；将脾脏充分研磨后过细胞筛，用少量无血清DMEM冲洗后加入50 mL离心管，1500 r/min离心5 min，弃上清，细胞沉淀用DMEM重悬，反复清洗3次后用DMEM调整脾细胞数目为108左右；将生长状态良好、处于对数生长期的骨髓瘤Sp2/0细胞用DMEM清洗2次，调整细胞数目为107左右（脾细胞∶Sp2/0细胞=10∶1）；将脾细胞和Sp2/0细胞加入50 mL离心管后混匀，1500 r/min离心5 min，小心弃上清，轻弹离心管底部使细胞松散；将离心管置于37℃温水中，1 min内缓慢加入1 mL PEG1500，边加边轻轻摇动，加完后静置90 s；在1 min内均匀加入1 mL DMDM，然后在2 min内均匀加入4 mL DMDM，800 r/min离心3 min；小心弃上清，用20 mL胎牛血清轻轻重悬细胞沉淀，加入准备好的胸腺细胞，混匀；同时准备30 mL经高压灭菌的半固体培养基，倒入含胸腺细胞的离心管中，上下颠倒混匀；均匀倒入25个细胞培养皿中，转移至37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.5 阳性杂交瘤细胞筛选

融合的细胞用半固体培养基筛选培养2周后，挑取细胞培养皿上的单克隆接种到96孔板（板中提前加入胸腺细胞，100 μL/孔），93个克隆/板，共挑取10块96孔板，置于培养箱中培养；3 d后，利用ELISA对杂交瘤细胞进行第1轮筛选。具体地，将96孔酶标板用2 μg/mL SNAP25抗原包被，100 μL/孔，4℃包被过夜，PBS-T 洗3次；用 2%脱脂牛奶作为封闭液，200 μL/孔，37℃封闭2 h，PBS-T洗3次；将杂交瘤细胞上清作为一抗加入96孔酶标板，100 μL/孔，同时设阴性对照（Sp2/0培养上清）、空白对照（PBS）和阳性对照（阳性血清用PBS按1∶1000稀释），37℃孵育1 h，PBS-T洗3次；HRP标记羊抗鼠IgG二抗用PBS按1∶20 000稀释后加入酶标板，100 μL/孔，37℃孵育1 h，PBS-T洗3次；加入TMB显色液，100 μL/孔，显色5 min；加入终止液，50 μL/孔，酶标仪读取D450nm值，记录保存数据。

对于第1轮筛选得到的阳性杂交瘤细胞，2 d后按照相同方法进行第2轮筛选，2轮筛选后得到的阳性杂交瘤细胞经扩大培养后及时冻存。

1.6 抗体亚型分析

取阳性杂交瘤细胞上清，利用抗体亚型鉴定试剂盒鉴定抗体亚型。

1.7 抗体大量制备及纯化

选取2只8～10周龄雌性BALB/c小鼠，腹腔注射0.5 mL灭菌的液体石蜡；1周后取0.5 mL密度为2×106/mL的杂交瘤细胞悬液，通过腹腔注射接种到小鼠腹腔内，诱发小鼠产生腹水；10～14 d后小鼠腹部明显膨大，用注射器抽取腹水，12 000 r/min离心20 min去除血脂和其他杂质，收集上清加入等体积结合缓冲液混匀，上样至用结合缓冲液平衡过的HiTrap Protein G亲和层析柱，平衡至基线后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱组分，利用SDS-PAGE检测抗体纯度。

2 结果

2.1 抗原SNAP25的纯化

将重组质粒pET30a-SNAP25转化大肠杆菌BL21（DE3），在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、于15℃诱导16 h的条件下，实现了SNAP25蛋白的可溶性表达，表达量约占全菌蛋白的26%。表达菌pET30a-SNAP25/BL21（DE3）经诱导表达后超声波破碎，取上清液用Ni2+-IDA亲和层析柱纯化，用含不同浓度咪唑的洗脱液洗脱，洗脱组分经SDSPAGE分析，在相对分子质量约25 000处可见特异性蛋白条带（图1），分子大小与目的蛋白的理论值相符。利用Gelpro32软件分析，SNAP25蛋白的纯度大于90%。

图1 SNAP25蛋白纯化的SDS-PAGE分析

2.2 小鼠血清效价

通过皮下注射SNAP25抗原对4只BALB/c小鼠进行4次免疫，第4次免疫7 d后眼眶取血收集血清，间接ELISA法检测血清效价，结果1～4号小鼠血清效价依次为6400、3200、3200、1600，1号小鼠血清效价最高，因此选取1号小鼠进行细胞融合实验。

2.3 阳性杂交瘤细胞筛选

融合后的细胞利用半固体培养基进行筛选培养，挑取细胞单克隆接种至96孔板，培养后取细胞上清利用ELISA对杂交瘤细胞进行第1轮筛选，得到21株阳性杂交瘤细胞，编号1～21。采用相同方法对这21株阳性杂交瘤细胞进行第2轮筛选，结果如图2，最终得到12株阳性杂交瘤细胞株（D450nm大于阴性对照5倍以上）。其中14号杂交瘤细胞株具有相对较高的抗原结合活性，因此选择14号杂交瘤细胞株进行抗体的大量制备。

图2 阳性杂交瘤细胞第2轮筛选

2.4 抗体亚型分析

对筛选得到的12株阳性杂交瘤细胞进行抗体亚型鉴定，确定这12株阳性杂交瘤细胞抗体的重链除3株为IgG2型外，其余均为IgG1型；轻链除2株为λ链外，其余均为κ链（表1）。

表1 12株阳性杂交瘤细胞抗体亚型

2.5 抗体纯化

用14号杂交瘤细胞株制备小鼠腹水，收集腹水离心取上清，采用HiTrap Protein G亲和层析柱纯化，SDS-PAGE检测抗体纯度。在相对分子质量约55 000和25 000处可见2条特异性条带（图3），分子大小分别与抗体重链、轻链的理论值相符。利用软件Gelpro32分析，抗体纯度大于90%。

图3 SNAP25抗体纯化的SDS-PAGE分析

3 讨论

本研究中我们利用杂交瘤技术制备针对SNAP25的单克隆抗体，以大肠杆菌表达的SNAP25蛋白作为免疫原对4只BALB/c小鼠进行了5次免疫，选取其中血清效价最高的小鼠进行细胞融合实验，融合的杂交瘤细胞经过2轮筛选，获得12株阳性杂交瘤细胞株。经ELISA检测，选择抗原结合活性较高的14号细胞株，扩大培养后注射到小鼠腹腔内诱发腹水产生，小鼠腹水经过亲和纯化，最终获得1株高纯度的单克隆抗体。

肉毒毒素是迄今发现的毒性最强的蛋白毒素，在人体中可以引发肉毒中毒。肉毒毒素共有40多种亚型，根据其毒性及抗原性的差异，主要分为A～G共7种血清型。其中A、B、E、F型容易引发人类肉毒中毒，C、D型主要引发动物肉毒中毒，G型则比较少见[7]。肉毒毒素是双链蛋白质，由通过二硫键连接的相对分子质量约100 000的重链（HC）和约50 000的轻链（LC）组成。肉毒毒素的重链C端包含受体结合结构域，能够与位于神经元细胞膜表面的神经节苷脂受体及某些特定蛋白质结合，通过内吞作用将轻链运送至胞内[8]。轻链是借助于Zn2+的蛋白酶[9]，通过在神经肌肉接头处切割SNAP25发挥作用。肉毒毒素的多种血清型都可以通过靶向参与神经递质释放的胞吐过程的SNAP25蛋白，达到抑制神经递质释放的作用。例如，A型肉毒毒素（BoNT/A）的轻链在氨基酸残基Gln197和Arg198之间切割SNAP25；E型肉毒毒素（BoNT/E）的轻链在氨基酸残基Arg180和Ile181之间切割SNAP25；C1型肉毒毒素（BoNT/C1）的轻链在氨基酸残基Arg198和Ala199之间切割SNAP25[10]。BoNT/A的轻链切割SNAP251-206后形成产物SNAP251-197，同时暴露出原先包埋于C端α螺旋内部的八肽抗原表位[11]。通过检测此八肽抗原，可以进行肉毒毒素活性的定性或定量测定。

我们制备了针对SNAP25的单克隆抗体，目前正在制备针对SNAP25的肉毒毒素切割产物的特异性抗体，可以将二者结合通过夹心ELISA检测肉毒毒素对SNAP25的切割活性，取代传统上检测肉毒毒素活性的小鼠生物测定法。此外，由于SNAP25对于调节神经递质释放及轴突生长具有重要作用，本研究制备的抗体可望用于人或动物大脑等组织中SNAP25表达水平的检测，有助于推动SNAP25在神经传导中的机制研究。