张 丹，秦 伟，刘慧芳，王晓雪，陈文倩，张相林

(中日友好医院药学部，北京 100029)

布洛芬作为非甾体抗炎药，具有镇痛、解热和抗炎的作用。其作用机制为通过抑制环氧酶活性，减少前列腺素合成，从而减轻前列腺素引起的组织充血、肿胀，降低周围神经痛觉的敏感性。此外，布洛芬还可通过作用于下丘脑体温调节中枢而发挥解热作用。目前，布洛芬混悬液是临床上治疗患儿急性发热的首选药物，同时用于毛细支气管炎或呼吸道感染后的喘息[1]及儿童外伤性疼痛[2-4]等。虽然布洛芬调节体温、镇痛的疗效明确，但临床研究结果发现其不良反应发生率较高，除常见的胃肠道反应、骨髓抑制等不良反应外，还可导致过敏性肝损伤[5]，并有低温症及急性肠胃炎导致脱水的患儿使用布洛芬后引发急性肾损伤的报道[6-8]。因此，检测布洛芬的血药浓度显得尤为重要。由于儿童患者的服药剂量较小，患儿体内药物暴露量较低，已报道的检测方法无法满足患儿体内布洛芬的血药浓度检测，且操作繁琐，时效性较差[9-10]。因此，本研究旨在建立一套快速、灵敏、简便、准确且稳定的超高效液相色谱检测方法，以检测儿童患者血浆中布洛芬的含量，以保证布洛芬用于儿童患者的有效性和安全性。

1 材料

1.1 仪器

超高效液相色谱仪(日本岛津公司)，包括LC-20AD泵、DGU-12AS在线脱气机、SIL-20AC自动进样器、CTO-20 A柱温箱、CBM-20 A系统控制器、SPD-M20 A 检测器及LabSolutians色谱工作站；JingLi LDZ5-2低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)；Sigma 3K15超高速离心机(美国Sigma公司)；CPA225D万分之一电子分析天平(德国 Sartorius公司)；Vortex Genie 2多用途旋涡混合器(美国Scientific Industries公司)；Milli-Q Advantage A10纯水机(法国Millipore公司)。

1.2 药品与试剂

布洛芬对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100179-201105，纯度>99.5%)，萘普生对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100198-200403，纯度>99.5%)；甲醇为色谱纯(美国Fisher公司)；H3PO4为分析纯；实验用水均为Millipore超纯水；空白血浆由中日友好医院(以下简称“我院”)检验科提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为0.1%H3PO4(pH=2.1)-甲醇(V∶V=30∶70)；布洛芬检测波长为220 nm，内标化合物萘普生检测波长为270 nm，流速为1.0 ml/min；柱温为35 ℃。布洛芬、萘普生的出峰时间分别为14.88、6.8 min。

2.2 布洛芬血浆样品的处理

准确吸取血浆样品190 μl于离心管中，加入内标溶液10 μl，甲醇溶液600 μl，涡旋混匀3 min，12 000 r/min下离心5 min，取上清液10 μl进样检测。

2.3 标准品储备液及内标溶液的制备

精密称取布洛芬对照品30.0 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成3 mg/ml的标准品溶液，分装并于-80 ℃冻存备用。精密称取萘普生对照品45.0 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成4.5 mg/ml的内标储备液，分装并于-20 ℃冻存备用。临用前，取内标储备液100 μl，加甲醇900 μl，涡旋混匀，即得0.45 mg/ml的内标溶液。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性验证：考查空白血浆中布洛芬和内标化合物的方法专属性。结果表明，布洛芬与内标基线分离且峰形良好，空白血浆中未见明显干扰，见图1。

A1、A2：空白血浆；B1、B2：空白血浆加标准品；C1、C2：患儿样本A1,A2: blank plasma; B1,B2: blank plasma and standard product; C1,C2: Samples图1 布洛芬专属性检测Fig 1 Exclusive detection of ibuprofen

2.4.2 标准曲线的制备：取空白血浆180 μl，分别加入不同浓度的布洛芬对照品溶液10 μl，使布洛芬质量浓度分别为1、1.5、10、15、100及150 μg/ml，按“2.2”项下方法进行处理，进样分析。以样品峰面积与内标峰面积比值为纵坐标(Y)，布洛芬质量浓度为横坐标(X)计算标准曲线。结果发现，布洛芬质量浓度在1～150 μg/ml范围内线性关系良好，线性回归方程为：Y=0.241 4X+0.002 3，r=0.999 9。定量限为1 μg/ml，符合生物样本检测的定量要求。

2.4.3 提取回收率试验：配制低、中及高3个质量浓度的布洛芬标准溶液(3、10及30 μg/ml)并测定，每个质量浓度重复5份，以样品或内标提取后的峰面积与样品或内标标准液的峰面积比值计算布洛芬的绝对回收率，见表1。

表1 布洛芬的提取回收率Tab 1 Recovery rate of ibuprofen

2.4.4 精密度和方法回收率试验：取布洛芬低、中及高3个质量浓度的标准溶液，每个质量浓度重复5份，依照“2.2”项下方法进行处理，进样分析后计算日内和日间精密度，结果见表2。

表2 布洛芬方法日内日间精密度及方法回收率Tab 2 Precision and method recovery in intraday and interday determination of ibuprofen

2.4.5 稳定性考察：取布洛芬低、中及高3个质量浓度的标准溶液，每个质量浓度重复5份，分别考查其在室温(25 ℃)条件下放置6 h的稳定性；考查标准溶液按“1.7”项下方法处理后，样本放置24 h的稳定性；考查标准溶液-20 ℃反复3次冻融后稳定性，进样分析。结果表明，该布洛芬该检测方法稳定、样本冻融稳定性良好，可满足生物样本中布洛芬的定量分析，见表3。

表3 稳定性考察结果Tab 3 Stability of ibuprofen

2.5 患者血药浓度测定

收集我院儿科10例进行布洛芬血药浓度监测患儿的血液样本，患儿经临床诊断为川崎病并口服布洛芬混悬液，每6 h服药1次，服用4次后，于第5次给药前取血，给药剂量、患儿信息及经上述方法检测的布洛芬血浆药物浓度见表4。结果显示，10例患儿布洛芬血浆药物浓度在1.16～13.88 μg/ml之间，大部分患儿维持在1～2 μg/ml。

表4 10例川崎病患儿布洛芬血浆药物浓度测定结果Tab 4 Determination of serum ibuprofen concentration in 10 cases of children with Kawasaki disease

3 讨论

布洛芬用于解热镇痛抗炎已被广大患者和医务人员所接受。其作用机制明确，疗效明显，不良反应小，成为了临床儿科解热镇痛的主要用药。前期研究中，对于布洛芬的浓度定量检测方法较多关注于原料药或制剂[11]，主要采用高效液相色谱的检测方法，方法的定量限在5～10 μg/ml左右[12-14]。布洛芬的药物浓度定量检测方法主要采用气相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法，方法的定量限在1.5 μg/ml左右[15-17]。血清中布洛芬药物浓度检测的样品处理过程复杂，操作繁琐，且主要应用于成人血清中药物浓度的检测。

本研究建立了基于超高效液相色谱法分析儿童患者体内布洛芬血药浓度的方法，前处理方法采用甲醇直接沉淀蛋白法，所需血浆样品量小，混匀后可直接取上清液进行分析测定，该提取方法操作简便且回收率高。由于儿童服用布洛芬的剂量较低，因此本方法的最低定量限为1 μg/ml，在1～150 μg/ml的范围内线性关系良好(r=0.999 9)，方法提取回收率约80%，日间和日内变异<5%，符合生物样本分析要求，能够满足儿童患者体内药物浓度的检测要求；且不受内源性物质的干扰，但有部分患儿存在合并外源性药物干扰的情况。本方法采用超高效液相色谱法和紫外检测器测定布洛芬的血药浓度，具有广泛的适用性。仪器分析周期为15 min左右，具有较高的分析速度和效率。本研究共收集了10份川崎病患儿服用布洛芬后的血浆样本进行药物浓度监测，患儿均规律服用布洛芬进行退热治疗，大部分患儿的血浆药物浓度保持在1～2 μg/ml之间，反映了患儿服用布洛芬后药物谷浓度的情况，对布洛芬在儿童患者血浆中药物浓度的测定提供了一定的数据参考。