周 伟，刘志刚

偏头痛是一种具有高发病率且反复发作的神经血管紊乱性疾病，严重影响人们的生活质量[1]。目前研究普遍认为偏头痛发病机制与三叉神经血管系统的激活有关，其中神经源性炎症是关键环节[2,3]。现有研究表明核转录因子-κB (nuclear factor-kappaB,NF-κB )及其下游炎性因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX2)以及降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)在神经源性炎症反应中发挥重要作用，且与偏头痛的发生密切有关[4～7]。

异氟烷(isoflurane，ISO)是广泛应用的吸入麻醉药，在神经系统急性损伤的过程中发挥抗氧化应激、抗凋亡及抗炎等作用[8,9]，因此推测其可能抑制偏头痛过程中的神经源性炎症和凋亡过程。

目前关于异氟烷作用于偏头痛三叉神经源性炎症的研究相对较少，本研究拟通过分析异氟烷处理对偏头痛大鼠行为及三叉神经节内IL-1β、NF-κB p65、COX-2及CGRP蛋白表达的影响，探讨可能涉及到的病理机制，为临床偏头痛的治疗提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年健康雄性SD大鼠40只，8～10 w龄，体质量220～250 g，由郑州大学实验动物中心提供。所有动物实验均通过河南大学第一附属医院伦理委员会批准通过。

1.2 实验方法 采用随机数字表法将SD大鼠分为对照组(S组)、模型组(M组)、ISO预处理组(包括低剂量组和高剂量组，即L组和H组)，每组10只。参照Tassorelli等[10]报道的方法制造偏头痛动物模型，即将除S组外的所有大鼠颈部皮下注射硝酸甘油10 mg/kg；S组给予等体积的生理盐水注射。以造模后大鼠出现双耳发红、前肢频繁挠头、爬笼次数增多、咬尾、往返运动等烦躁不安的症状视为造模成功，本研究中除S组外的所有大鼠均造模成功。ISO(100 ml/瓶，国药准字H20020267，鲁南贝特制药有限公司)处理方法：L组和H组大鼠在接受造模前30 min分别给予1%和2%ISO吸入30 min，M和S组不进行ISO吸入处理。

1.3 行为学检测 (1)造模后观察大鼠耳红出现和消失的时间；(2)从完成造模时开始至造模后210 min的时间段内，以每30 min为一个时间区间，观察并记录各组大鼠各时间段(T1-7)的挠头、爬笼次数[11]。

1.4 Western blot检测蛋白表达水平 建模后4 h，采用3.5%的水合氯醛腹腔注射深度麻醉大鼠，断头分离三叉神经节，于-80 ℃冰箱保存。分别采用细胞核蛋白和细胞浆蛋白抽提试剂盒提取心肌组织核蛋白和胞浆蛋白，严格按照试剂盒说明书操作。其中胞浆蛋白用于检测IL-1β、NF-κB p65、COX-2及CGRP蛋白的表达水平，胞核蛋白用于胞核NF-κB p65蛋白的表达。BCA法测定蛋白浓度后。分别取20 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5 m处时关闭电源，取出胶板转膜(PVDF膜)，采用5%BCA室温封闭2 h，分别加入NF-κB p65抗体、IL-1β抗体、COX-2抗体、CGRP抗体、β-actin抗体和TBP 抗体(1∶1000) 4 ℃孵育过夜，然后室温孵育羊抗兔或羊抗鼠二抗(1∶2000)1 h。化学发光显影后采用Image J计算目的条带与内参条带灰度值的比值，即目的蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1 大鼠行为学症状的改变 与S组相比，M组和ISO预处理组大鼠均出现双耳发红及挠头、爬笼次数增多等现象，差异有统计学意义(P<0.05)；ISO预处理组大鼠耳红消失的时间较M组明显缩短，T2-7时挠头次数均明显减少，T2-6时爬笼次数均明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1～表3)。

2.2 三叉神经节内 IL-1β、COX-2及CGRP蛋白表达水平比较 M组大鼠与S组相比，IL-1β、COX-2及CGRP蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)； ISO预处理组大鼠随着剂量的增加，与M组相比，IL-1β、COX-2及CGRP蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)(见图1)。

2.3 三叉神经节内NF-κB p65蛋白表达水平比较 M组大鼠三叉神经节内NF-κB p65胞核蛋白水平较S组明显升高，胞浆蛋白水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；ISO预处理组与M组比NF-κB p65胞核蛋白水平明显降低，且呈剂量依赖性，而胞浆NF-κB p65蛋白水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)(见图2)。

表1 各组大鼠出现耳红及耳红消失的时间比较

与S组比较*P<0.05;与M组比较#P<0.05;与L组比较&P<0.05

表2 各组大鼠各时间段挠头次数比较(次

与S组比较*P<0.05;与M组比较#P<0.05;与L组比较&P<0.05

表3 各组大鼠各时间段爬笼次数比较(次

与S组比较*P<0.05;与M组比较#P<0.05;与L组比较&P<0.05

与S组比较*P<0.05;与M组比较#P<0.05;与L组比较&P<0.05

图1 各组大鼠三叉神经节内IL-1β、COX-2及CGRP蛋白表达水平比较

与S组比较*P<0.05;与M组比较#P<0.05;与L组比较&P<0.05

图2 各组大鼠三叉神经节内NF-κB p65在胞核及胞浆中的表达水平比较

3 讨 论

偏头痛是最常见的头痛类型，且多发于中青年人群，严重影响患者的工作和生活。偏头痛的发病机制较为复杂，与遗传、内分泌代谢、精神压力、不良生活习惯等相关，其中三叉神经血管系统的激活是在众多偏头痛发病机制研究中占主导地位[3,12]。三叉神经血管系统激活后，三叉神经末梢释放出多种具有促炎、血管活性及致痛作用的神经递质，导致偏头痛的发生和进展[12]。NF-κB是炎性过程中的关键转录因子，主要调控早期炎症反应的信号通路，其靶基因主要位于脑血管内皮细胞、神经细胞和胶质细胞等[4,13]。Galeotti等[14]研究发现，硝酸甘油诱导的偏头痛大鼠三叉神经尾核神经元内NF-κB被激活，而活化的NF-κB可促进IL-1β等炎症细胞因子释放，引起神经源性炎症，诱导三叉神经致敏，导致偏头痛发生。COX-2是一种诱导酶，在组织损伤、炎症等情况下表达增强[15]。Nagy-Grocz等[16]研究发现COX-2被NF-κB调控，在偏头痛发作时介导神经源性炎症反应，并上调痛觉敏感性。CGRP是一种三叉神经节神经元异常合成并释放的具有致痛作用的神经递质，可以引发颅内、外血管扩张，促进神经源性炎性反应发生，在偏头痛的发生中扮演重要角色[7,17]。同时研究发现CGRP的释放是由依赖COX-2活性的PGE2诱导的。姚刚等[18]研究发现，大鼠皮下注射硝酸甘油可以激活大鼠的三叉神经血管系统，上调大鼠三叉神经节神经元CGRP的基因表达。本研究采用皮下注射硝酸甘油制备偏头痛大鼠模型，结果发现偏头痛大鼠均出现双耳发红及挠头、爬笼次数增多的现象，提示模型建立成功。同时在偏头痛大鼠三叉神经节内NF-κB p65、炎性因子IL-1β、炎性介质COX-2及致痛神经递质CGRP的表达水平明显增加，进一步证实NF-κB p65、IL-1β、COX-2及CGRP与偏头痛的发生有关，与以往的研究结论一致。

ISO是临床上常用的吸入性麻醉剂，其作用靶点广泛分布于大脑皮质、脑干和脊髓等中枢神经系统。近年研究显示适量ISO对于脑缺血再灌注损伤、脑缺氧性损伤、蛛网膜下腔出血等多种中枢神经系统急性损伤具有良好的神经保护作用，其保护机制与抗凋亡、抗炎等作用有关[8,9,19,]。吕慧敏等[8]研究表明，ISO对创伤性脑损伤有良好的神经保护作用，其机制与上调P13K/Akt的活性相关；Wang等[20]研究表明ISO可通过抑制p38MAPK/NF-κB信号通路，降低小鼠Kupffer细胞内的炎症反应；Zhang等[21]研究表明ISO可通过抑制COX2的活性，减少CGRP的释放，改善神经病理性疼痛。本研究结果显示，ISO预处理能缩短偏头痛大鼠耳红消失的时间，降低挠头、爬笼次数，抑制三叉神经节内胞核NF-κB p65蛋白及胞浆IL-1β、COX-2、CGRP蛋白的表达水平，说明ISO预处理能改善偏头痛大鼠的行为学症状，其作用机制可能与抑制NF-κB的激活，降低炎性因子IL-1β、炎性介质COX-2以及致痛神经递质CGRP的释放有关。同时H组的效果明显优于L组，提示ISO的使用剂量对偏头痛的改善效果有影响，但最佳剂量仍需要进一步的研究才能得出准确结论。

综上所述，异氟烷能改善偏头痛大鼠的行为学症状，抑制偏头痛发作时三叉神经血管系统激活后引起的神经炎症反应，其机制可能与下调三叉神经节内IL-1β、COX-2及CGRP蛋白的表达水平，抑制NF-κB的激活有关。