郑勤妮　杨通华　庄丽　万永虎　任丽娟　付林　李世军　唐光鹏

【摘 要】目的：分析2012-2014年贵州省流感病毒活动规律，为贵州省的流感防控工作提供科学依据。方法：采集全省12家国家级哨点医院流感样病例患者的鼻咽拭子。利用实时荧光定量PCR（real-timePCR）方法进行检测分析，用MDCK细胞进行病毒分离培养。结果：（1）RT-PCR结果对33473份流感样病例咽拭子进行核酸检测，检出阳性标本3783份，检出率为11.30%，其中B型Yamagata系（BY）677份，B型Victoria系（BV）471份，B型混合型26份，A（H1N1）亚型908份，A（H3N2）亚型1690份。2012年BV和A（H3N2）同时共存，分别占总阳性率的48.21%和49.44%。2013年BY、A（H1N1）和A（H3N2）同时共存，分别占总阳性率的31.39%、48.91%和19.48，以A（H1N1）占优势。2014年以A（H3N2）占绝对优势，阳性率为65.27%。（2）MDCK细胞分离结果对1616份阳性标本进行病毒培养，分离出毒株923株，分离率为57.12%。其中，BY、BV、A（H1N1）H和A（H3N2）亚型分别占13.24%、8.72%、14.36%和20.79%。结论：贵州省2012-2014年流感病毒呈交替流行，这提示应注意基因频繁交替变异新毒株的出现。

【关键词】流感病毒;监测;MDCK细胞;RT-PCR

【中图分类号】R373.13【文献标识码】A【文章编号】1672-3783（2019）12-03--01

流行性感冒病毒（influence virus）简称流感病毒，可引起急性呼吸道传染病-流行性感冒（简称流感）。流感为第一个实行全球性监测的传染病，同时也是至今无法完全加以控制的一种病毒性急性呼吸道传染病[1]。流感病毒属于正粘病毒科，为单股、负链、分节段RNA病毒，分为甲（A）、乙（B）和丙（C）三型。流感病毒表面抗原HA和NA容易发生变异，导致每年季节性流感和偶尔流感大流行的发生，在全球范围内导致一定的经济和健康负担[2-4]，流感并发症可引起年老体弱者一定的死亡率[2，5，6]。1957年2月贵州省首发甲2（H2N2）亚型流感病毒，被称之为亚洲流感病毒[7]，为了更好地了解贵州省流感病毒活动的特征，本文对2012-2014年间贵州省流感病毒的活动规律进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源

标本来自贵州省9个市（州）疾病预防控制中心流感监测网络实验室及12家哨点医院。依据《全国流感监测技术指南》在哨点医院呼吸内科、儿科、急诊科采集发热3d或3d之内未服用抗病毒药物的流感样病例患者的鼻咽拭子，采集对象为发热、腋下体温≥38℃，伴有咳嗽或咽喉疼痛之一。

1.1.2 MDCK细胞系 MDCK细胞均由中国疾病预防控制中心病毒病所提供。

1.1.3 主要试剂 改良的1640培养基（含L-谷氨酰胺）（CatNo.11965）;青、链霉素母液（10000U/mL青霉素G;10000?g/mL硫酸链霉素，CatNo.SV30010）;TPCK-胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）;胎牛血清（CatNo.16000）均购自美国GIBCO公司;EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na，CatNo.25300）;Hepes缓冲液，1M母液 （CatNo.SH30237.01）;0.75%牛血清白蛋白组分V（CatNo.RS0007）;Na2HCO3（CatNo.SH30033.01）均购自美国Hyclone公司;1M的PBS液购自美国GIBCO公司，1.5%豚鼠血，核酸提取试剂盒。

1.1.4 主要仪器 生物安全柜和CO2培养箱购自美国Thermo Scientific公司;倒置显微镜（EVOS）购自美国Life Technologies公司;荧光定量PCR仪（ABI7500）购自美国ABI公司;低温离心机购自美国SIGMA公司;4℃冰箱和-80℃超低温冰箱购自中国青岛Haier公司。

1.2 方法

1.2.1 標本的处理 所采集的标本经震荡20min混均后，吸取200ul样品进行病毒核酸的提取，剩余的样品中加入5%的双抗4℃处理4小时或者过夜，以备MDCK细胞分离用。

1.2.2 MDCK细胞培养 参照全国流感方案操作。

1.2.3 病毒核酸提取 提取试剂盒为德国QIAGEN公司的The RNeasy Mini Kit（50），具体操作步骤见试剂盒说明书。

1.2.4 Real-Time PCR扩增 （达安试剂盒），具体方法见试剂盒说明书。

1.2.5 病毒分离培养 吸取1mL经PCR检测阳性的双抗处理好的标本，接种到生长状态和形态均良好的MDCK细胞单层上，于35℃孵育1.5h，弃去标本液，PBS洗细胞两遍，加入5mL病毒生长液，于35℃培养，24h时开始每日观察细胞病变，24h内病变的细胞属非特异性病变，达到90-100%的细胞脱落时收获病毒培养液。

2 结果

2.1 RT-PCR监测结果

2012-2014年贵州省共检测流感样病例标本33473份，RT-PCR核酸检测阳性3783份，阳性率为11.30%。其中，BY 亚型677份，占17.90%，BV亚型471份，占12.54%，混合型23份，占0.69%，A（H1N1）亚型908份，占24.00%，A（H3N2）亚型483份，占44.67%。2012年共检测标本数为6829份，检出核酸阳性977份，阳性率为14.31%。其中，BV和A（H3N2）亚型分别为471、483份， 占48.21%和49.44%，为两种病毒同时共存，并检出23份混合毒株。2013年共检测标本数为12138份，检出核酸阳性1335份，阳性率为11%。BY、A（H1N1）和A（H3N2）亚型分别为419、653和260份， 占31.39%、48.91%和19.48%，为三种病毒共存，其中A（H1N1）占优势毒株，检测到3株混合型。2014年共检测标本数为14506份，检出核酸阳性1451份，阳性率为10%。BY、A（H1N1）和A（H3N2）亚型共存，A（H3N2）亚型947份，占65.27%，占绝对优势毒株。

2.2 流感病毒MDCK细胞分离结果 2012-2014年贵州省共检测核酸阳性标本3853份，对1616份标本进行了流感病毒的分离培养（由各个网络实验室进行分离），分离到流感病毒923株，分离率为57.12%，其中214株BY亚型，141株BV亚型，232株A（H1N1）亚型，336株（AH3N2）亚型。2012年分离BV亚型毒株141株，分离率为20.17%，成为主要毒株。2013年分离BY和A（H1N1）亚型毒株分别为154、174株，分离率为33.45%和38.93%。2014年分离A（H3N3）亚型毒株261株，分离率为55.53%。

3 讨论

流感病毒的变异与流感的暴发和流行密切相关，流感病毒正是通过不断改变其抗原性来逃逸宿主的特异性免疫识别和清除，从而引起流行[8]。2012-2014年贵州省流感病毒监测核酸结果提示，贵州省在这三年间检出BY、BV、A（H1N1） 和A（H3N2）流感病毒，这与全国流感监测结果一致。2012年 BV和A（H3N2）亚型分别占阳性率的48.21%和49.44%，为两种病毒同时共存，BV占48.21%的阳性率，呈现一个流行高峰，这与2011年B型流感病毒在我国局部地区小规模的爆发相符[8]。2013-2014年BV消失，且2013年A（H3N2）亚型的检出率下降，这可能与流行高峰后人们对流感病毒有一定的免疫力有关。相反2013年BY和A （H1N1）的检出率升高，分别占阳性率的31.39%和48.91%，这可能与流感病毒通过不断改变抗原性来逃脱宿主的免疫有关[7]。2014年A（H3N2）亚型流感病毒又呈现出明显升高的趋势，2014年检出A（H3N2）亚型流感病毒947份，占阳性率的65.27%，成为绝对优势毒株。由此表明，2012-2014年间，贵州省流感病毒的流行特征为各亚型毒株交替出现。其中值得注意的是A（H3N2）亚型流感病毒在这三年间均与其余亚型共存，2012和2014年均以优势毒株出现，这就提示我们在警惕流感病毒基因频繁变异下新毒株出现的同时，还应注重A（H3N2）亚型流感病毒的防控。

组织细胞培养法分离流感病毒是流感实验室诊断的“金标准”[7]。该方法不受流感病毒株抗原变化影响，能监测新的流行的流感病毒亚型出现，为新一代流感疫苗的制备提供依据。流感病毒组织细胞分离阳性率与实验室能力、流感病毒流行强度、病毒型别和接种标本盲传代次有关，2012-2014年贵州省流感病毒细胞分离阳性率与核酸检测阳性率相符。RT-PCR核酸检测和细胞分离结果显示，2012年细胞分离BV系141株，占20.17%。这与2011年BV流行有关，而A（H3N2）分离率低，可能与实验室能力有关。2013年细胞分离BY系154株，占33.45%，A（H1N1）亚型174株，占38.93%，这与核酸检测的结果相符。2014年细胞分离A（H3N2）亚型265株，占55.53%，与核酸检测结果相符合。2012-2014年间细胞分离毒株数与上毒阳性标本数呈反相关，这可能主要与实验室能力和接种标本盲传代次有关。细胞分离方法是用于流感病毒的分离、培养的常规方法。因此，稳定实验室检测队伍，加强质量控制，规范操作和增加标本盲传代数是提高细胞分离流感病毒的保障。

参考文献

.de Mateo S，Larrauri A and Mesonero C.Influenza surveillance.New solutionsto an old problem[J].Gac Sanit，2006.20（1）：67-73.

張果.流感季节性流行的影响[J].卫生软科学，2011.25（2）：132-134.

曾晓旭，王大燕，舒跃龙.B型流行性感冒病毒基因进化研究进展[J].中华预防医学杂志，2013.47（7）：656-659.

DeGroot AS，Ardito M and Terry F，etal.De Low immunogenicity predicted for emerging avian-origin H7N9：implication for influenza vaccine design[J].Hum Vaccin Immunother，2013.9（5）：950-956.

Beck ET and Henrickson KJ.Molecular diagnosis of respiratory viruses[J].Future Microbiology，2010.5（6）：901-916.

Tregoning JS and Schwarze J.Respiratory viral infections in infants： causes，clinicalsymptoms，virology and immunology[J].Clin Microbiol Rev，2010.23（1）：74-98.

郭元吉，程小雯著.流行性感冒病毒及其实验技术.北京：中国陕西出版社，1997.249.

黄维娟，谭敏菊，蓝雨等.2011-2012年度中国B型流感病毒病原学特征分析[J].病毒学报，2013.29（1）：32-38.