丁煜哲 田 坤

（西安高新第一中学 陕西西安 710000）

1 引出问题

盐代谢紊乱是目前公认的对心脑血管和肾脏产生损害，是引起冠心病、中风和肾衰竭等的重要风险因子［1-2］，人们选择降低食盐的摄入量，以减少盐代谢紊乱可能带来的疾病风险。然而，在已有的细胞与动物研究中，食盐的使用浓度非常宽泛（20～160 mmol／L）［3-5］，高浓度食盐的使用会引起研究系统内的渗透压改变，从而过高评估食盐所带来的危害。如何选取合理的食盐刺激与给予浓度，是正确评估食盐毒性的关键因素。本项目利用人血管内皮细胞系（HUVEC），对比了不同盐浓度刺激下的细胞形态改变与细胞凋亡情况，证明了选择合理盐浓度刺激的重要性；同时根据筛选的最优盐浓度，检测了在该浓度刺激条件下，食盐对细胞活力、增殖以及凋亡的影响。食盐的主要成分是氯化钠，为了便于控制浓度，本文选用分析纯的氯化钠作为食盐用于之后的研究中。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料 HUVEC 细胞系购于上海生命科学院菌种保存中心；氯化钠、蔗糖等试剂购于国药集团；Cell Counting Kit-8 细胞增殖试剂盒及Annexin-V&PI 细胞凋亡试剂盒购于碧云天生物科技有限公司；主要科研平台借助西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系实验室。

2.2 实验方法

2.2.1 倒置显微镜细胞形态观察 以1×105个／孔为浓度，将细胞接种于12 孔细胞培养板，同时给予不同浓度（0 mmol／L、20 mmol／L、40 mmol／L、60 mmol／L、80 mmol／L 和160 mmol／L）的食盐刺激，分别培养12 h、24 h、48 h 和72 h 进行观察、拍照。

2.2.2 Countstar 细胞活力评估 以1×105个/孔为浓度，将细胞接种于12 孔细胞培养板，分别给予60 mmol／L蔗糖和60 mmol／L 氯化钠刺激，24 h 后胰酶消化收集细胞，用0.4%台盼蓝染色后，5 min 内在Countstar 自动细胞计数仪分析。

2.2.3 CCK-8细胞增殖以1×104个/孔为浓度，浆细胞接种于96 孔细胞培养板，分别给予60 mmol／L蔗糖和60 mmol/L氯化钠刺激，在培养0 h、24 h、48 h 和72 h 后 加 入10 μL 的CCK-8染色，37℃孵育1 h 后，在酶标仪中用450 nm 波长测定吸光度。

2.2.4 Annexin-V&PI 流式检测细胞凋亡 以1×105个/孔为浓度，将细胞接种于12 孔细胞培养板，分别给予60 mmol/L 蔗糖和60 mmol／L 氯化钠刺激，72 h 后胰酶消化收集细胞，离心后弃去上清液，加入200 μL Binding Buffer，充分混匀，再加入10 μL Annexin V-FITC，以及5 μL PI 轻轻混匀避光，置于4℃下反应30 min，1 h 内流式上机检测。

3 实验结果

3.1 不同盐浓度刺激下的细胞形态变化 根据文献中经常使用的盐浓度，笔者选择了0 mmol／L、20 mmol／L、40 mmol／L、60 mmol／L、80 mmol／L 和160 mmol／L 作为刺激条件，观察不同时间刺激后，HUVEC 细胞形态发生的变化。主要基于高浓度的食盐刺激，必然引起细胞的失水，细胞形态会发生较大的变化，结果如下图1所示。细胞在160 mmol／L 的盐刺激条件下，细胞生长在各个时间点都受到明显抑制，细胞形态不均一，推测可能出现凋亡与坏死；80 mmol／L 的盐刺激条件下，细胞生长在72 h 稍微出现抑制，而形态改变并不明显；在其余浓度与时间点，细胞形态与生长密度都没有明显异常。

图1 不同浓度氯化钠刺激的细胞形态学观察（200×）

3.2 不同盐浓度刺激下的细胞凋亡情况 根据食盐高浓度刺激下的细胞状态，笔者推测细胞可能已处于凋亡或坏死状态，为此，通过流式细胞术Annexin-V 和PI 的共染，证明此时的细胞凋亡与坏死情况，结果如图2（见封四）所示。

根据图2所示，细胞在160 mmol／L和80 mmol／L的2 个点都出现了大幅度的细胞凋亡与坏死，说明此时的细胞是由于渗透压改变出现的整体性凋亡与坏死，而其余浓度下细胞凋亡与坏死并不显著。需要强调的是，因为HUVEC 属于贴壁细胞，胰酶消化会造成部分细胞的凋亡与坏死，所以对照中尽管没有食盐刺激，但还是有少许的凋亡与坏死存在。结合图1 和图2，笔者认为60 mmol／L 是一个比较理想的刺激浓度，一方面保证了较高的食盐浓度，另一方面并不因渗透压的改变而对细胞造成整体性影响。之后的实验中选择该浓度为最适的食盐刺激浓度。

图2 不同盐浓度刺激下的细胞凋亡与坏死情况（200×）

3.3 60 mmol／L 食盐刺激下的细胞活力 在确定了适合的盐浓度后，该浓度的食盐刺激会对细胞活力有何影响？除了选择60 mmol／L 的食盐刺激，在对照组中加入了同样浓度的蔗糖，以排除可能的微小的渗透压影响，结果如图3 和表1所示。

图3 蔗糖和氯化钠最优刺激浓度下细胞经台盼蓝染色后结果比较（200×）

表1 60 mmol／L 蔗糖与氯化钠刺激下的细胞活力参数

根据图3 和表1 的结果，相比较于60 mmol／L的蔗糖刺激，氯化钠对于细胞的活力的影响非常有限，经台盼蓝染色后，2 组细胞间的差异不大，只有微小的细胞活率降低，而细胞直径、平均圆度等都不受影响。

3.4 60 mmol／L 食盐刺激下的细胞增殖 在观察了细胞形态，检测细胞凋亡与细胞活力后，利用CCK-8 试剂盒检测了60 mmol／L 氯化钠对HUVEC 细胞增殖的影响，同样选择60 mmol／L 的蔗糖作为对照，按照实验方法介绍的步骤，获得了12 h、24 h、48 h 和72 h 的光吸收值，根据光吸收值的大小，说明细胞的增殖情况，结果如图4所示。

根据图4 结果，发现在72 h 时氯化钠刺激组表现出明显的细胞增殖抑制，而在其他时间点并未出现，说明氯化钠对细胞增殖的影响是需要一定时间积累才会出现，也证实食盐的毒害作用可能随着时间的推移逐步积累。

图4 最优浓度下氯化钠对细胞增殖的影响

4 实验讨论

本项目作为一个高中生研究性的学习案例，在关注食盐对内皮细胞损伤研究时发现，以往的课题研究在食盐浓度的选择上非常宽泛，考虑到渗透压改变可能会带来细胞生长的致命性损害，尽管食盐本身也能带来渗透压的损害，但这种损害是在一定程度内，人类也可以通过增加摄水调整食盐浓度，但过高盐浓度使用结论会误导大众对食盐毒性的认识，且过度的降低食盐摄取同样危害健康；同时为了寻找最优的食盐作用浓度，本项目通过对细胞形态观察，细胞活力、增殖和凋亡的检测证明60 mmol／L 是一个比较理想的食盐作用浓度。本项目能解决研究食盐对内皮细胞损伤研究时在选择合理食盐浓度的困惑，但是食盐对机体的影响是复杂的，不仅限于内皮细胞，机体是一个复杂的网络互做模式，之后还需要更为深入的研究；同时对于参与项目学习的高中生而言，对于渗透压，以及细胞生长、增殖、凋亡的研究也有利于加强对这些概念的理解。