王英新，刘 玲，李树英，兰 颐，聂 磊

(1山东大学药学院，济南 250012；2山东达因海洋生物制药股份有限公司，荣成 264300)

白三烯为引发哮喘的重要炎性介质，其在哮喘患儿气道中存在，可增加哮喘患儿呼吸道血管通透性，导致支气管黏膜水肿和平滑肌收缩，促进黏液栓形成，可导致支气管阻塞加重，引发哮喘发作。孟鲁司特钠为选择性白三烯受体拮抗剂，其与白三烯受体具有良好的亲和力，用药后可与白三烯竞争受体，对炎症反应进行抑制，从而发挥抗炎和抗哮喘作用。孟鲁司特钠适用于成人和儿童哮喘的预防和长期治疗，包括预防白天和夜间的哮喘症状；能够缓解哮喘急性发作，减少激素用量，提高患儿用药的依从性[1]；也适用于治疗对阿司匹林敏感的哮喘患者及预防运动引起的支气管收缩，具有良好的临床效果[2-3]。

孟鲁司特钠颗粒剂为儿童哮喘预防和治疗的常用药，但目前尚未见关于孟鲁司特钠颗粒杂质谱与杂质来源详细解析的相关文献报道。有关物质作为药品质量的重要属性，关系用药安全，同时明确杂质种类与产生途径对制剂工艺开发与产品质量控制具有重要意义。因此，本文采用HPLC-MS/MS对市售孟鲁司特钠颗粒(顺尔宁，规格4 mg)的杂质谱进行了研究，探究了其杂质谱中各杂质的来源与生成途径，以期对该品种的制备工艺制定及产品质量控制提供参考和指导。

1 材 料

1.1 试剂与药品

孟鲁司特钠颗粒(顺尔宁®，规格4 mg；美国Merck sharp & Dohme公司，批号0000522303与0000546722)；孟鲁司特钠EP杂质对照品均购自加拿大Molcan公司：杂质对照品B(批号121107，含量97.6%)、杂质对照品C(批号121016，含量91.9%)、杂质对照品D(批号121008，含量95.3%)、杂质对照品E(批号121018，含量96.7%)、杂质对照品G(批号121014，含量90.1%)；孟鲁司特钠原料(牡丹江恒远药业有限公司，批号150801)。甲醇、乙腈、三氟乙酸为色谱纯，水为超纯水(电阻系数≥18.2 MΩ·cm，本实验室制备)。

1.2 仪 器

高效液相质谱联用仪(美国安捷伦公司，包含1290高效液相色谱仪、6460 Triple Quad LC/MS质谱、Mass Hunter工作站)。

2 方 法

2.1 检测条件

色谱条件：菲罗门苯基-己基柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相A：0.15%三氟乙酸水溶液；流动相B：0.15%三氟乙酸乙腈；梯度洗脱流动相A比例变化：0～10 min 为60%，10～25 min由60%～32%，并保持32%至40 min，40.1 min变更为60%，并持续至45 min；流速1.0 mL/min；检测波长238 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL。

质谱条件：电喷雾电离源，正离子化，喷雾电压4 000 V，雾化器压力50 psi(1 psi=6.895 kPa)，毛细管温度350 ℃，碰撞气为高纯氮气，碰撞电压50 eV。

2.2 样品制备

供试品溶液(避光操作)：称取孟鲁司特钠颗粒3 g(约相当于孟鲁司特钠25 mg)研细，置50 mL量瓶中，加甲醇-水(9∶1)的混合溶液，振摇使溶解，0.45 μm滤膜过滤即得。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下供试品溶液适量，光照约5 min，生成孟鲁司特钠顺式异构体，得系统适用性溶液。精密量取20 μL进样测定，记录色谱图，顺式异构体与孟鲁司特钠的分离度不小于2.5。

3 结 果

3.1 有关物质测定与杂质对照品定位

采用HPLC-VWD(紫外可见检测器)法检测孟鲁司特钠颗粒样品的有关物质杂质谱，并使用孟鲁司特钠EP杂质对照品进行色谱保留时间定位，定位结果如图1所示。

Figure1 Montelukast sodium granule related substances and impurity references positioning

A:Montelukast sodium granule impurity spectrum;B:Montelukast+ impurity references (B-G)

在孟鲁司特钠颗粒中检测出7种有关物质(编号1～7)，其中有关物质1、3、4、5、6的保留时间分别与孟鲁司特钠EP杂质对照品C、G、E、D、B一致,可能对应为同种物质，进而采用质谱法进行进一步的鉴定确认。

3.2 杂质鉴定

采用HPLC-MS/MS法测定了孟鲁司特钠颗粒有关物质1～7及孟鲁司特钠EP杂质对照品(B、C、D、E、G)的分子离子([M+H]+)与二级碎片离子信息，测定结果见表1与图2。

Table1 Mass spectra results of montelukast sodium related substances

Compd.t/min[M+H]+(m/z)Secondaryfragmention(m/z+)References/MMontelukast20.1586——19.9602440,472,584C/601.21210.8602440,472,584—317.8586422,440,568G/585.21419.1732311,343,456,586E/731.25519.3732311,343,453,569D/731.25625.6568—B/567.20726.9602131,157,294,438—

Figure2 Mass spectra of montelukaste sodium releated substance (A-H)

A：Impurity1;B：Impurity2;C：Impurity3product ion;D：Impurity4;E：Impurity5;F：Impurity6;G：Impurity7;H：Impurity7product ion

测定结果表明，孟鲁司特钠颗粒中的有关物质1、3、4、5、6的分子离子与二级碎片离子分别与孟鲁司特钠EP杂质对照品C(亚砜)、G(顺式异构体)、E(迈克尔加成物2)、D(迈克尔加成物1)、B(甲基苯乙烯)一致,可以确定其分别对应为同一物质；杂质2与7的相对分子质量较孟鲁司特大16，推测此二者为孟鲁司特的氧化产物(分子内增加1个氧原子)，在孟鲁司特分子中硫原子与氮原子可被氧化,产物分别为含亚砜与喹啉环氮氧化物结构的化合物。查阅文献，欧洲药典8.0、美国药典40表明EP杂质C(亚砜)存在立体异构体，共存的异构体在色谱上呈现为相邻的双峰[4-5]，杂质2在相对分子质量与色谱行为上满足以上特征，因此判定杂质2是杂质1(亚砜)的异构体。假定杂质7为喹啉环氮氧化物，在此基础上进行二级碎片离子解析，结果表明假定与实验结果具有较高的吻合度(图3)，表明杂质7较可能为喹啉环氮氧化物，该杂质未见相关文献报道。

3.3 杂质来源分析

从孟鲁司特钠(原料)的合成工艺、强制降解实验及制剂工艺等方面进行分析，以明确孟鲁司特钠颗粒杂质1～7的来源途径。

3.3.1 原料合成工艺杂质分析 孟鲁司特钠原料与颗粒均由默克公司研制，孟鲁司特钠合成路线[6]如图4所示，结合“3.2”项中对杂质1～7的鉴定结果，判定杂质4、5、6应来源于合成工艺，杂质4、5为孟鲁司特钠母核分子中双键发生迈克尔加成反应生成，杂质4和5的生成途径见图5；杂质6为甲基磺酰氯(MeSO2Cl)进攻分子中多余的羟基生成的副产物，杂质6的生成途径见图6。

Figure3 Structure analysis of impurity7

Figure4 Synthesis pathway of montelukast sodiums

Figure5Formation route of impurities4and5

Figure6Formation route of impurity6of montelukast sodium

3.3.2 孟鲁司特钠降解杂质分析 根据文献调研信息[7]与“3.2”项中杂质鉴定结果，杂质1、2、3、7应为降解产物。取孟鲁司特钠颗粒，分别进行酸、碱、氧化、光照与高温破坏，确认杂质1、2、3、7的降解途径。

氧化降解样品溶液制备：精密称取孟鲁司特钠颗粒3 g(约相当于原料25 mg)，置50 mL棕色量瓶中，加入甲醇-水(9∶1)混合溶液5 mL，加30%过氧化氢溶液2 mL，室温避光放置10 min，加混合溶液定容，摇匀，即得。

光降解样品溶液制备：精密称取孟鲁司特钠颗粒3 g(约相当于原料25 mg)，置50 mL无色透明量瓶中，加入甲醇-水(9∶1)混合溶液约30 mL，超声1 min，置5 500 lx光照强度下照射约3.5 h，取出，加混合液定容，摇匀，即得。

酸降解样品溶液制备：精密称取孟鲁司特钠颗粒3 g(约相当于原料25 mg)，置50 mL棕色量瓶中，加入乙腈-水(9∶1)混合溶液5 mL，再加入0.1 mol/L的盐酸溶液2 mL，60 ℃烘箱加热3 h，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液2 mL，加乙腈-水(9∶1)混合溶液定容，摇匀，即得。

高温降解样品溶液制备：精密称取孟鲁司特钠颗粒3 g(约相当于原料25 mg)，置50 mL棕色量瓶中，加入甲醇-水(9∶1)混合溶液适量，于80 ℃水浴避光加热10 d，取出，放冷至室温，加混合溶液定容，摇匀，即得。

碱降解样品溶液制备：精密称取孟鲁司特钠颗粒3 g(约相当于原料25 mg)，置50 mL棕色量瓶中，加入甲醇-水(9∶1)混合溶液5 mL，再加入0.1 mol/L的氢氧化钠溶溶液2 mL，80 ℃水浴避光加热10 d，取出，放冷至室温，加入0.1 mol/L盐酸溶液2 mL，加混合溶液定容，摇匀，即得。

取上述样品溶液注入高效液相色谱仪测定，降解实验色谱图如图7所示。

孟鲁司特钠颗粒在氧化、光照、酸性条件下稳定性较差，在高温与碱性条件下较稳定(图谱中的杂质1、2是在空气中氧化所致)。强制降解实验确认了杂质1、2、3、6可通过降解途径产生，其中杂质1、2来源于氧化降解，实验中发现随降解强度的增加，降解量呈等比例增长，表明杂质1、2的生成具有相关性，结合“3.2”项鉴定结果，杂质1、2的生成过程应如图8所示；杂质3来源于光照降解，据EP8.0孟鲁司特钠标准可知在光照条件下孟鲁司特钠可转化为顺势异构体，因此杂质3应为孟鲁司特钠的顺势异构体，其转化过程为双键两侧基团由反式构型转化为顺势构型(图9)。酸性降解条件下产生较大量的杂质6，根据“3.2”项杂质6的鉴定结果，判定孟鲁司特钠在酸性条件下可通过分子内羟基脱水途径生成杂质6(图10)。杂质7在降解实验未见产生。

Figure7 Degradation experimental chromatography

a：Oxidative degradation;b：Light degradation;c：Acid degradation;d：Thermal degradation;e：Alkaline degradation

Figure8 Formation route of impuritys1and2

Figure9 Formation route of impuritys3of montelukast sodium

Figure10 Acid degration pathway of montelukast sodium

3.3.3 制剂工艺杂质分析 实验中发现孟鲁司特钠原料中未检测到有关物质7，但以该原料按照默克公司孟鲁司特钠颗粒制备工艺[8]制备所得的颗粒样品中却检测到了该杂质，说明有关物质7来源于颗粒制剂工艺。颗粒的制备工艺过程具体为先将甘露醇与羟丙基纤维素溶液经流化床(氮气做流化气)制粒干燥(约60 ℃)成空白颗粒，再将空白颗粒与孟鲁司特钠水溶液经流化床(氮气做流化气)制粒干燥(约60 ℃)成含药颗粒，最后将含药颗粒与硬脂酸镁物理混合制得成品。模仿该工艺条件下物料所处环境(60 ℃，低氧)进行实验，发现孟鲁司特钠与羟丙基纤维素相互作用产生杂质7，因孟鲁司特钠分子中具有喹啉环，查阅相关文献，表明喹啉环结构上的氮原子在弱氧化条件下加热能接受氧原子而生成喹啉环氮氧化合物，该反应在强氧化条件下不易发生[9]，据此并结合“3.2”项对杂质7鉴定的结果，判定杂质7较可能为孟鲁司特钠喹啉环氮氧化合物，推断其是孟鲁司特钠在低氧高温条件下喹啉环上的氮原子被辅料羟丙基纤维素或羟丙基纤维素中的环氧丙烷(制备工艺残留)氧化生成。

4 结 论

孟鲁司特钠颗粒存在7个有关物质(编号为1～7)，其中有关物质1、2、3为降解杂质，4、5、6为原料合成工艺杂质，7为制剂工艺杂质。有关物质1、2来源于氧化降解途径，为分子内的硫原子氧化生成的具亚砜基团的化合物，两者互为立体异构体；有关物质3来源于光照降解途径，为孟鲁司特钠(反式)的顺式异构体；有关物质4、5为合成反应时侧链酸与孟鲁司特母核上的双键发生加成反应生成的副产物，互为非对映异构体；有关物质6为合成反应时孟鲁司特钠母核中的羟基在甲基磺酰氯的作用下脱水生成，降解实验表明，有关物质6也较易通过酸性条件下羟基脱水的方式生成；有关物质7推断是喹啉环氮氧化物，是在高温弱氧化条件下(约60 ℃的氮气流中)孟鲁司特钠分子中喹啉环上的氮原子被辅料羟丙基纤维素(或其中含有成分)氧化生成，其生成量与受热温度与时间有关，温度越高，受热时间越长，生成量越大。

孟鲁司特钠在光照与氧化条件下稳定性较差，生产制备过程中应注意避光、避氧。来源于颗粒制剂过程的有关物质7未见相关文献报道，按照ICH分类属于非特定杂质，其控制限度较低(通常不大于0.1%)，研究发现有关物质7较易超过控制限度，导致产品质量不合格，因此，在生产过程中应严格控制物料的加热温度与受热时间，加热温度越低，受热时间越短，有关物质7的生成量越低。