刘润奇，高学忠，罗锐娟

东莞市人民医院乳腺科，广东 东莞5230000

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率约占恶性肿瘤的10%，且呈逐年升高趋势[1]。有文献报道，早期乳腺癌患者经手术治疗联合放化疗的治愈率达90%左右[2]，但临床对于晚期乳腺癌的治疗尚缺乏有效手段，因此，探寻乳腺癌的早期诊断标志物具有重要的价值。miRNA是近年来发现的一类长度为18～24个核苷酸的内源性小RNA[3]。以往的研究显示，miRNA在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达存在一定的差异[4]。有研究报道，循环miRNA可长期稳定地存在于血浆或血清中[5]，其中血清miRNA-135a-5p已被证实与子宫内膜癌[6]、结直肠癌[7]等恶性肿瘤密切相关，但其在乳腺癌中的表达情况及其诊断效能尚未明确。因此，本研究对比分析了82例乳腺癌患者、43例乳腺增生患者及40例健康体检者的血清miRNA-135a-5p表达水平，旨在为乳腺癌的早期临床诊断提供参考。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年1月至2018年8月于东莞市人民医院诊治的82例乳腺癌患者（乳腺癌组）和43例乳腺增生患者（乳腺增生组），并选取同期40例健康体检者作为健康对照组。乳腺癌患者的纳入标准：乳腺癌根治术后经病理学检查确诊为原发性乳腺癌且为初发病例。排除标准：①有放化疗史；②合并其他恶性肿瘤。乳腺癌组患者的年龄为34～72岁，平均年龄为（51.26±7.35）岁；病理类型：浸润型导管癌43例，浸润型小叶癌39例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期48例，Ⅲ期34例。乳腺增生患者的纳入标准：经临床检查确诊为乳腺增生[8]且为初发病例。排除标准：妊娠或哺乳期女性。乳腺增生组患者的年龄为33～71岁，平均年龄为（50.49±6.28）岁。健康体检者的纳入标准：①女性；②乳腺检查结果无异常。排除标准：①重要脏器检查结果异常；②合并血液系统疾病。健康对照组受试者的年龄为32～71岁，平均年龄为（50.03±6.13）岁。3组受试者的年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，且3组受试者均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 样本收集

3组受试者均于确诊后第1天或体检当日清晨采集空腹外周血4～5 ml，室温静置30 min，以离心半径15 cm、转速1500 r/min离心10 min后，取上层血清于新的离心管中，于-80℃低温箱中保存待检，整个过程避免溶血。

1.3 主要试剂和仪器

miRNA-135a-5p和U6（内参基因）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成。miRNA-135a-5p上游引物：5'-ACAGCCTCCATGGGAA-3'，下游引物：5'-TGGAGTGTGGCGTTCG-3'；U6 上游引物：5'-CTCGCGCAGCCTTGACA-3'，下游引物：5'-AACTTCGGAATTGCACT-3'。血清RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒均购自日本TaKaRa公司，实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，紫外分光光度计购自美国赛默飞公司。

1.4 检测方法

血清总RNA提取：分别取血清500 μl，按照血清RNA提取试剂盒说明书提取血清总RNA，并应用紫外分光光度计检测RNA的纯度及浓度。逆转录反应：按照逆转录试剂盒操作说明书进行操作，将提取的血清总RNA逆转录为cDNA，反应体系为20 μl。配制混合物：总RNA 300 ng，5×实时（real-time，RT）缓冲液 4 μl，逆转录特异性引物 1 μl，脱氧核糖核苷酸 2 μl，RNA 酶抑制剂 1 μl，逆转录酶 1 μl，加焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC），水补至 20 μl。逆转录反应条件：42℃反应60 min，70℃反应5 min，产物置于4℃保存。miRNA-135a-5p定量PCR检测：按照PCR试剂盒操作说明书进行PCR扩增，反应体系：SYBR GreenⅠ混合液 10 μl，U6 上、下游引物各 0.25 μl，miRNA-135a-5p上、下游引物各0.25 μl，cDNA 6 μl，无RNA酶水3 μl。定量PCR扩增反应条件：95℃反应10 min，95℃反应15 s，60℃反应1 min，共40个循环。采用相对定量法，以U6为内参，各样本中miRNA-135a-5p的含量为其与同样本中U6的相对表达量。采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件分析数据。非正态分布的计量资料以中位数（四分位数）[M（P25，P75）]表示，采用Mann-Whitney U检验；正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料以例数及率（%）表示；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价血清miRNA-135a-5p在乳腺癌中的诊断效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组受试者血清miRNA-135a- 5 p相对表达量的比较

乳腺癌组、乳腺增生组、健康对照组受试者的血清miRNA-135a-5p相对表达量分别为2.396（1.042，4.363）、0.934（0.399，1.916）、0.919（0.188，1.402）。乳腺癌组患者的血清miRNA-135a-5p相对表达量高于乳腺增生组和健康对照组，差异均有统计学意义（U=608.5、589.5，P＜0.05），而乳腺增生组和健康对照组受试者的血清miRNA-135a-5p相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 不同基线特征的乳腺癌患者血清miRNA-135a- 5 p相对表达量的比较

不同年龄、绝经状况、病理类型、肿瘤直径的乳腺癌患者的血清miRNA-135a-5p相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；TNM分期为Ⅲ期、分化程度为低分化的乳腺癌患者的血清miRNA-135a-5p相对表达量均高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、分化程度为中高分化的患者，差异均有统计学意义（U=203.0、214.0，P＜0.05）。（表1）

表1 不同基线特征的乳腺癌患者血清miRNA-135a- 5 p相对表达量（ n=82）

2.3 ROC曲线分析

采用ROC曲线评价血清miRNA-135a-5p在乳腺癌中的诊断效能，其曲线下面积为0.846（95%CI：0.608～0.972），诊断的灵敏度为81.52%，特异度为70.35%。（图1）

3 讨论

乳腺癌为临床常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年升高且呈年轻化趋势[9]，给乳腺癌的临床防治带来极大挑战。尽管手术联合同步放化疗可提高早期乳腺癌的临床治愈率，但对于晚期乳腺癌尚缺乏有效的治疗手段[10]。因此，探寻乳腺癌的发病机制，明确其早期诊断的生物学标志物成为临床研究的重点。近年来，随着临床对乳腺癌标志物的不断探究，miRNA越来越受学者的关注，成为肿瘤生物标志物研究的新领域[11]。已有研究证实，miRNA-29[12]、miRNA-141[13]、miRNA-320[14]等与乳腺癌的发生发展存在相关性。虽然miRNA对乳腺癌的早期诊断具有一定的价值，但多数研究基于肿瘤组织或细胞的miRNA表达差异，在获得检测miRNA的肿瘤组织时需行穿刺或有创手术等[15]，因此，此种检测方式不便于临床乳腺癌的广泛筛查。研究显示，miRNA在血液、唾液和尿液中也能被检测到，且外周血miRNA作为肿瘤标志物已取得一定的成效[16]。Cardoso等[17]报道，血清miRNA-155与乳腺癌的进展密切相关。另有研究报道，miRNA-21、miRNA-195、miRNA-222在早期乳腺癌患者血清中的表达上调，其对乳腺癌诊断的灵敏度分别为63.3%、70.0%和70.0%，特异度分别为86.7%、93.3%和90.0%[18]。以上研究结果说明，血清miRNA有望成为乳腺癌的诊断标志物，miRNA-135a-5p为miRNA-135家族的重要成员，位于第3号染色体，已被证实与多种恶性肿瘤密切相关[19]，而其与乳腺癌的关系尚未明确。本研究结果显示，乳腺癌患者、乳腺增生患者、健康体检者的血清miRNA-135a-5p中位相对表达量分别为2.396、0.934、0.919；乳腺癌患者的血清miRNA-135a-5p相对表达量高于乳腺增生患者和健康体检者（P＜0.05）。Taipaleenmäki等[20]报道，miRNA-135在转移性乳腺癌患者血清中高表达，这与本研究结果一致。本研究结果还显示，乳腺癌患者血清miRNA-135a-5p相对表达量与患者的年龄、是否绝经、肿瘤直径、病理类型无关；TNM分期为Ⅲ期、分化程度为低分化的乳腺癌患者的血清miRNA-135a-5p相对表达量均高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、分化程度为中高分化的患者（P＜0.05）。临床监测乳腺癌患者血清miRNA-135a-5p水平可能对患者的疾病发展及预后评价有一定的意义。进一步采用ROC曲线评价血清miRNA-135a-5p在乳腺癌中的诊断效能，其曲线下面积为0.846（95%CI：0.608～0.972），诊断的灵敏度为81.52%，特异度为70.35%，提示血清miRNA-135a-5p对乳腺癌具有较高的诊断效能。综上所述，与乳腺增生患者、健康体检者比较，miRNA-135a-5p在乳腺癌患者血清中的相对表达量较高，同时血清miRNA-135a-5p对乳腺癌诊断的灵敏度和特异度均较高，其可能成为乳腺癌临床诊断的生物学标志物之一。今后，需扩大样本量，深入探讨血清miRNA对恶性肿瘤的诊断效能，以期为临床诊疗提供更有价值的参考。