张梦娇 ，王春艳 ，黄亚若 ，隆红艳 ，司振阳 ，杨月娥

1南京中医药大学附属南京中医院 中心实验室，南京 210012；2南京中医药大学，南京 210046；3南京中医药大学附属南京中医院 儿科，南京 210012

多发性抽动症（tourette syndrome，TS）是一种慢性神经精神障碍性疾病，临床表现为不自主的、反复的肌肉抽动引发的运动性抽动和发生性抽动[1，2]。该病多起肇于儿童时期，常以眨眼伴面肌抽动为首发症状，其后病情可逐渐加重，相继出现其他部位的运动性抽动，伴或不伴发生性抽动；部分患儿可合并多动症、强迫障碍、焦虑等异常行为及情绪问题[3，4]。抽动症的病因和发病机制尚不清楚，可能与神经生化因素、环境因素、遗传因素、社会心理因素、A族β-溶血性链球菌感染等因素有关[5]。

大量研究表明，抽动症的发生发展与大脑纹状体内炎症因子的表达有密切关系，降低大脑纹状体内炎症因子表达有利于缓解和治疗抽动症的症状[6]。

目前抽动症模型以 1-（2，5-dimethoxy-4-iodo pheny l）-2-aminopropane（DOI）诱发大鼠为主，该模型较其他模型明显而稳定，表现效度较好，能够较好地模拟人类抽动症行为学特征。脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是革兰阴性杆菌细胞壁的主要组分，可以诱发炎症反应，破坏免疫系统功能。本实验首次通过DOI联合LPS造模，增强了抽动症模型大鼠的稳定性。

玉屏风散是中医补益类的代表方，具有益气固表止汗之功效[7]。许多研究表明，玉屏风散可以增强机体自身免疫力，减轻机体组织损伤及炎症反应。

本实验以TLR/NF-κB信号通路为基础，结合抽动症的发病机理，探讨了其相关蛋白在抽动症大鼠大脑纹状体组织中的表达变化及玉屏风散是否通过调节TLR/NF-κB信号通路、从而起到治疗作用。

1 材 料

1.1 药品与试剂

玉屏风散配方颗粒由南京中医药大学附属南京中医院提供（由黄芪、白术、防风组方，配制比例为 2∶2∶1，批号 20170204，购自江阴天江药业）。

玉屏风水煎液：按《中华人民共和国药典》的标准，取黄芪、防风和白术配方颗粒。黄芪∶炒白术∶防风＝3∶1∶1，制备高、低浓度组，其生药浓度分别是0.27 g·mL-1、0.135 g·mL-1。1-（2，5-dimethoxy-4-iodo pheny l）-2-aminopropane（DOI，批号 #549495）、脂多糖（LPS，批号 L6511），均购自 Sigma 公司。盐酸硫必利（批号H32025447，江苏恩华药业股份有限公司）；IL-1β（E-EL-M0037c）、IL-6（E-ELN-M0047c）和TNF-α（E-EL-M0049c）酶联免疫试剂盒由Elabscience 公司提供；TLR 2（#12276）、TLR 4（#14358）、p-IκB α（#2859）、IκB α（#4812）、NF-κBp65（#8242）和 p-NF-κBp65（#3033）抗体，均由 Cell Signaling Technology（Danvers，USA）公司提供。

1.2 仪器

BS124S-电子天平 （北京赛多利斯仪器系统有限公司）；D3024-台式高速微量离心机、D3024R-台式高速微量冷冻型离心机、SK-L180-E-摇床（美国Scilogex公司）；RT-6000-酶标分析仪 （深圳雷杜生命科学有限公司)）；GZX-9070 MBE-数显鼓风干燥箱 （上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；FR-200-塑料薄膜封口机（蓝莓牌）；PHS-3L-pH计（上海雷磁仪器厂）；Tanon 5200-曝光仪 （上海天能科技有限公司）；F6/10-手持式高速匀浆器 （上海净信科技）；DYC系列电泳仪 （北京市六一仪器厂）；Flyde动物行为学仪器（江苏赛昂斯生物科技有限公司）。

1.3 动物

60只雄性SD大鼠（体重200~220 g，合格证号SCXK（Jing）2017-0008）由扬州大学比较医学中心提供。大鼠于22℃±1℃、空气湿度40%~50%、昼夜交替时间12h条件下普通饲料喂养，自由饮水。

2 方 法

2.1 动物分组与给药

将60只SD大鼠随机分为5组：空白组、模型组、硫必利组（15mg·kg-1）、玉屏风散低剂量（3.25 g·kg-1）组、玉屏风散高剂量（6.5 g·kg-1）组。除空白组外，其他各组大鼠于腹腔注射1mg·kg-1DOI与1mg·kg-1LPS联合制备大鼠抽动症模型。空白组以等体积生理盐水代替造模剂，共造模21天。同时，硫必利组灌胃给予15 mg·kg-1硫必利和玉屏风散低、高剂量组分别灌胃给予 3.25 g·kg-1、6.5 g·kg-1的玉屏风散；空白组和模型组给予等体积生理盐水，每天1次，共21天。

2.2 行为学测试

（1）运动行为学评估：最后一次给药后24 h，将动物放入一个较大的观察笼，动物适应5 min，参照文献评分：0分为安静或正常活动；1分为过度兴奋；2分为探究性为增加，不连续吸鼻；3分为不停跑动；4分为不停跑动伴有惊跳。（2）刻板行为学评估：参照Diammond方法对刻板行为评分，评分标准：0分为无抽动或刻板运动；1分为耸肩及口腔运动、理毛、舔食前爪等刻板动作或旋转行为；2分为头和颈部上下运动过多；3分为头、颈部上下运动过多加旋转行为；4分为头向侧面摆动合并头、颈部上下运动过多。（3）分类刻板行为学评估：参照文献，记录大鼠的面部刻板运动，这些刻板运动包括：口爪运动、吃木屑、自咬、摆头（左右和上下摆动幅度较大）、旋转、舞蹈样运动（身体直立，两前爪抓笼子，头及上半身左右摆动）、舔咬笼子。在1 h观察时间内，记录上述刻板行为出现的次数，每出现一次记1分。测试完毕后观察笼内的排泄物并清洁笼舍，以消除对下一大鼠的影响。连续观察7天后每7天观察一次直至造模结束。整个过程采取盲法观察并记录，由两人分别观察影像数据，以减少主观误差、且上述行为学数据由Flyde动物行为学仪器采集。

2.3 血清和大脑纹状体组织中炎症因子的测定

行为学评分后，将大鼠用3%的水合氯醛麻醉，颈总动脉取血适量，4 500 r·min-1离心15 min，取上清血清液，冻存于-80℃备用。快速分离出大脑组织，将大脑纹状体组织置于生理盐水中匀浆，4℃、12 000 r·min-1离心10 min，取上清液冻存于-80℃备用。采用BCA法测定蛋白含量。按照ELISA试剂盒说明书检测血清和大脑纹状体组织中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量。

2.4 大脑纹状体免疫学检查

行为学评分后，将大鼠用3%的水合氯醛麻醉，颈总动脉取血适量，快速分离出大脑组织，并在冰浴上剥离出纹状体组织，生理盐水洗净，固定于10%的中性福尔马林溶液中，脱水后用石蜡包埋，做成4~5μm切片，染色并于光学显微镜下观察并记录。

2.5 Western blot分析

采用western blot检测大鼠TLR/NF-κB信号通路相关蛋白 TLR2（1∶1000）、TLR4（1∶1000）、p-IκB α（1∶1 000）和 p-NF-κBp65（1∶1 000）表达。大脑纹状体组织总蛋白用RIPA裂解液进行提取，12 000 r·min-1离心15 min，收集上清液。采用BCA试剂盒进行蛋白定量。蛋白样品置于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，直至样品到达分离胶的底部，并将其转移到PVDF膜上。转膜完毕后，将条带浸入5%脱脂牛奶中封闭2 h。封闭结束后，将PVDF膜分别浸入一抗中，于4℃孵育过夜。第二天弃一抗加入第二抗体于摇床、室温孵育2 h。二抗孵育结束后，弃抗体，取出PVDF膜用TBST清洗3次。使用凝胶成像系统进行曝光并用凝胶扫描成像系统扫描条带，分析各条带的灰度值。

2.6 统计学分析

运用Graphpad Prism统计学软件进行单因素方差分析。实验结果以均数±标准差（±s）表示。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 玉屏风散对抽动症大鼠行为学的影响

由表1所示：（1）玉屏风散对抽动症大鼠运动行为评分的影响：与空白组相比，模型组大鼠在观察期内的运动行为评分均高于正常组，给予15 mg·kg-1硫必利及 3.25 g·kg-1、6.5 g·kg-1的玉屏风散后，大鼠的运动行为评分均降低。（2）玉屏风散对抽动症大鼠刻板行为评分的影响：与空白组相比，模型组大鼠在观察期内的刻板行为评分均高于空白组，给予 15 mg·kg-1硫必利及 3.25 g·kg-1、6.5 g·kg-1的玉屏风散后，大鼠的运动行为评分均降低。（3）玉屏风散对抽动症大鼠分类刻板行为评分的影响：与空白组相比，模型组大鼠在观察期内的口爪运动、吃木屑、自咬、摆头等分类刻板运动评分均高于空白组， 给予 15mg·kg-1硫必利及 3.25 g·kg-1、6.5g·kg-1的玉屏风散后，大鼠的口爪运动、吃木屑、自咬、摆头等分类刻板运动评分均降低。

3.2 玉屏风散对抽动症大鼠血清和大脑纹状体组织中炎性细胞因子表达的影响

由表2、表3所示：模型组大鼠血清和大脑纹状体组织中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子含量显著增加。与模型组相比，硫必利组（15 mg·kg-1）、玉屏风散低剂量（3.25 g·kg-1）组、玉屏风散高剂量（6.5 mg·kg-1）组的动物血清和大脑纹状体组织中IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性细胞因子含量显著降低。表明玉屏风散可以通过减少炎症因子的表达缓解大鼠抽动症的症状。

表1 玉屏风散对抽动症大鼠行为学评分的影响（x±s，n=6）

表2 玉屏风散对抽动症大鼠血清炎性细胞因子表达的影响（x±s，n=6）

表3 玉屏风散对抽动症大鼠纹状体炎性细胞因子表达的影响（x±s，n=6）

3.3 玉屏风散对抽动症大鼠大脑纹状体组织NF-κB免疫组化染色的影响

由图1所示：空白组大鼠大脑纹状体组织免疫组化染色基本呈阴性。其他实验组大脑纹状体组织中NF-κB在细胞及间质中均有阳性表达。模型组中NF-κB阳性表达明显比空白组多，说明造模成功。硫必利组NF-κB阳性表达明显低于模型组。玉屏风散低、高剂量组阳性表达同样明显低于模型组，说明该散对抽动症大鼠具有一定的保护作用。见表4。

图1 玉屏风散对抽动症大鼠大脑纹状体组织NF-κB免疫组化染色的影响（免疫组化，×200，n=3）

3.4 玉屏风散对抽动症大鼠大脑纹状体组织TLR/NF-κB信号通路蛋白表达的影响

采用Western blot检测玉屏风散对TLR/NF-κB信号通路相关蛋白的改善作用。由图2与表5所示：与空白组相比，模型组大鼠 TLR2、TLR4、p-IκBα、和p-NF-κBp65的表达上调，经玉屏风散低剂量（3.25 g·kg-1）组、玉屏风散高剂量（6.5 g·kg-1）组治疗后，这些蛋白的表达显著下调。结果表明，玉屏风散是通过TLR/NF-κB信号通路体现其对抽动症大鼠的治疗作用。

表4 玉屏风散对抽动症大鼠大脑纹状体组织NF-κB 阳性表达率的影响（±s，n=3）

表4 玉屏风散对抽动症大鼠大脑纹状体组织NF-κB 阳性表达率的影响（±s，n=3）

玉屏风散 低高组别 剂量（mg·kg-1） NF-κB阳性表达率（%）空白 - 7.43±1.22模型 - 27.87±1.18#硫必利 15 11.78±2.66▲3250 16.55±1.79▲6 500 13.66±1.71▲

图2 玉屏风散对抽动症大鼠大脑纹状体组织TLR/NF-κB信号通路蛋白表达的影响

表5 玉屏风散对抽动症大鼠纹状体TLR/NF-κB信号蛋白表达的影响（±s，n=3）

表5 玉屏风散对抽动症大鼠纹状体TLR/NF-κB信号蛋白表达的影响（±s，n=3）

P-IκB α/IκB α空白 - 0.43±0.07 0.65±0.11 0.22±0.08 0.49±0.09模型 - 0.88±0.17#1.24±0.19#0.89±0.14#0.99±0.15#硫必利 15 0.58±0.12▲0.84±0.15▲0.38±0.06▲0.65±0.13▲3250 0.67±0.16▲0.98±0.23▲0.48±0.09▲0.78±0.11▲6500 0.62±0.13▲0.84±0.29▲0.44±0.05▲0.70±0.16▲组别 剂量（mg·kg-1）TLR 2/GAPDH TLR 4/GAPDH P-P65/P65玉屏风散低高

4 讨 论

抽动症是一种起病于儿童时期、以无目的、不自主的、快速、反复一个或多个部位肌肉运动性或发生性抽动为特点的神经经神障碍疾病[8]。常伴随注意缺陷多动障碍、强迫障碍及自伤行为等，对患者的生活质量和心理功能造成严重的损伤[9]。该病的病理基础是基底神经节功能紊乱及多巴胺系统活动增强，但具体发病机制仍不明确[10]。目前抽动症模型以 1-（2，5-dimethoxy-4-iodo pheny l）-2-aminopropane（DOI）为主，该模型抽动行为学体征较其他模型明显而稳定，表现效度较好，能够较好地模拟人类抽动症行为学特征[11]。本实验通过DOI联合LPS造模，增强了抽动症模型大鼠的成模性、稳定性。

IL-6是神经-内分泌-免疫功能的发生改变的重要介质和多种生物学效应的促炎因子。IL-1β是重要的炎症细胞因子之一，介导炎症反应的发生发展。TNF-α由单核细胞和巨噬细胞产生，是机体损伤期间反应最早和最强的介质[12，13]。在本研究中，模型组大鼠血清和大脑纹状体组织中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子含量显著增加。与模型组相比，硫必利组（15mg·kg-1）、玉屏风散低剂量（3.25 g·kg-1）组、玉屏风散高剂量（6.5 g·kg-1）组的动物血清和大脑纹状体组织中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子含量显著降低，表明玉屏风散可以通过减少炎症因子的表达缓解大鼠抽动症的症状。

最后，采用免疫组化和Western blot技术检测纹状体TLR/NF-κB信号蛋白表达水平，核转录因子NF-κB是最重要的调控蛋白，参与细胞生存、免疫应答和炎症反应等细胞生命活动。它由五个家族成员组成，静息状态下以同源二聚体或异源二聚体的形式存在，通过结合IκB家族蛋白，从而限制自身入核参与下游基因转录[14，15]。TLR 2、TLR 4 分布于除T细胞、B细胞、NK以外的免疫细胞。大量研究表明，TLR 2、TLR 4与炎症关系非常密切[16]。

总之，本研究表明，玉屏风散可以缓解DOI联合LPS诱导的大鼠抽动症，其机制可能与TLR/NF-κB信号通路相关。