王 辉,曾晓房,,冯卫华,,于立梅,翟万京,白卫东,,曾令钢

(1.仲恺农业工程学院轻工食品学院,广东广州 510550;2.广东中兴绿丰发展有限公司,广东河源 517000)

我国是柠檬种植大国,2013年全国柠檬种植面积高达5万公顷,且柠檬平均每亩产量高达1066.7千克[1]。柠檬果肉可食用,但柠檬皮呈苦味,以提取柠檬精油、果胶、膳食纤维等加工为主。柠檬皮中含有丰富的柠檬苦素,柠檬苦素及其类似物是一类含有4,4,8-三甲基-17-呋喃基甾体基本骨架结构的化合物。目前已分离出36种柠檬苦素类似物和19种配糖体,包括柠檬苦素、诺米林、诺米林酸、奥巴叩酮等[2]。已发现柠檬苦素类化合物具有抑菌、杀虫、消炎、抗肿瘤等作用[3-4]。根霉(Rhizopus)是广泛存在于自然界中的一类真菌,是酿造业常用的糖化菌,但也会引起食物等霉变[5]。已有利用罗汉果、木醋液、植物黄酮、黄芩提取物等对根霉的抑菌性能的研究[5-8]。也有关于柠檬苦素抑菌活性的研究,如李彪等[9]发现柚子皮中柠檬苦素对小麦纹枯病原菌、水稻纹枯病原菌等的生长有一定抑制作用;李赤翎等[10]发现柠檬苦素类似物对细菌与真菌的抑制效果明显。但尚未有柠檬苦素对根霉的抑菌活性和抑菌机理的研究。

因此,本文以根霉为研究对象,通过测定柠檬苦素对根霉的MIC、MBC、孢子萌发抑制率和菌丝生长抑制率确定抑菌活性,并进一步研究了多种因素对抑菌活性的影响。同时,通过测定根霉胞外蛋白质含量、碱性磷酸酶(AKP)活力、菌丝体总糖含量,并结合扫描电镜观察,初步阐述柠檬苦素对根霉的抑菌机理,为开发柠檬苦素作为天然抑菌剂应用于食品领域提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脱脂柠檬皮粉 广东中兴绿丰发展有限公司提供;根霉(Rhizopus) 仲恺农业工程学院轻工食品学院微生物实验室保藏;马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基、马铃薯葡萄糖液体(PDB)培养基 广东环凯微生物科技有限公司;柠檬苦素标准品(纯度99.98%) 济宁天之蓝生物科技有限公司;碱性磷酸酶试剂盒 上海酶联生物科技有限公司;考马斯亮蓝-G250、蒽酮 北京索莱宝科技有限公司;福林试剂、石油醚、二氯甲烷、无水乙醇等 均为分析纯。

JEOL-6360LV型扫描电子显微镜、JFD-320型冷冻干燥仪、JFC-1600型离子溅射仪 日本电子株式会社;DDS-18A型精密数字式电导率仪 上海日岛科学仪器有限公司;SW-CJ-1FD型净化工作台 苏州安泰空气技术有限公司;PYX-280S-A型生化培养箱 韶关市科力实验仪器有限公司;UV759型紫外分光光度计 上海横摇科技有限公司;DSX-280型手提式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;THZ-82型冷冻水浴恒温振荡器 金坛市中大仪器厂;XHRE-52A型旋转蒸发仪 郑州豫华仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 柠檬皮中柠檬苦素溶液的制备 10 g脱脂柠檬皮粉中加入400 mL 80%乙醇溶液,60 ℃下振荡提取120 min后真空浓缩至10 mL。浓缩液加入等体积的二氯甲烷重复萃取5次后,40 ℃下真空旋转蒸发得到柠檬苦素结晶。使用时以适量15%乙醇溶液溶解制得柠檬苦素溶液[11]。

1.2.2 孢子悬浮液的制备 向根霉的PDA斜面培养物中加入无菌生理盐水,将孢子洗脱,后用400目灭菌纱布过滤制得孢子悬浮液,用血球计数板计数调整孢子悬浮液浓度为108个/mL,4 ℃冰箱保藏,备用。

1.2.3 柠檬苦素抑制根霉活性的测定

1.2.3.1 MIC及MBC的测定 用试管法测定MIC。用移液枪移取2 mL质量浓度为10000 μg/mL柠檬苦素溶液于1号试管中;接着从第1管中移取1 mL液体于2号管中;按照此倍半稀释法稀释至8号管。1～8号试管分别加入0.9 mL PDB培养基和0.1 mL根霉孢子悬浮液。9号试管为空白对照,只加入培养基和柠檬苦素溶液,不接种菌液;10号管为菌液对照组,不加入柠檬苦素溶液,均以无菌水代替。28 ℃培养箱培养2 d[12]。以试管中无菌生长的最低浓度柠檬苦素浓度为MIC。分别从无菌生长的试管中各取100 μL液体涂布于PDA平板培养基,28 ℃培养箱培养5 d,以培养皿中无菌生长的最低柠檬苦素浓度为MBC。

孢子萌发抑制率(%)=(对照组萌发数-处理组萌发率)×100/对照组萌发数

1.2.3.3 菌丝生长抑制率的测定 在培养皿中分别加入不同质量浓度(如1.2.3.2)的柠檬苦素溶液和PDA培养基,充分混匀,使每个平板培养基中柠檬苦素溶液的最终浓度分别为1250、625、312.5、156.25、78.125 μg/mL,备用。从用PDA培养基培养3 d的根霉菌落边缘取直径为4 mm的菌饼,将菌饼分别接种于平板培养基正中央,每个平板接种一个菌饼,菌丝面朝下,28 ℃培养箱中培养3 d。每组重复3次。用十字交叉法测量菌落直径。以不同柠檬苦素浓度的对数值和菌丝生长抑制率,计算柠檬苦素对菌丝生长的毒力方程和半最大效应浓度EC50[14]。以15%无水乙醇为溶剂对照。

菌落直径(mm)=测量菌落平均值-打孔器直径

菌丝生长抑制率(%)=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)×100/对照组菌落直径

1.2.4 不同因素对柠檬苦素抑制根霉活性的影响

1.2.4.1 抑菌圈测定方法 在每个含根霉孢子浓度为106个/mL的PDA平板培养基上用打孔器打出3个直径6 mm的小孔,分别加入85 μL柠檬苦素样液、15%乙醇、无菌水,28 ℃培养箱中培养48 h。每组重复3次。用十字交叉法测量其抑菌圈直径。

1.2.4.2 不同温度对柠檬苦素溶液抑制根霉活性的影响 将柠檬苦素溶液置于40、60、80、100 ℃恒温加热30 min,若加热后出现体积损失,则用15%乙醇调节至原体积,处理完毕后按照“1.2.4.1”测定抑菌圈直径。

1.2.4.3 不同pH柠檬苦素溶液的配制 配制不同pH的缓冲溶液,与柠檬苦素溶液以3∶1的比例混合,制成pH分别为2、4、6、8、10的柠檬苦素样液后按照“1.2.4.1”测定抑菌圈直径。

1.2.4.4 明胶对柠檬苦素抑制根霉活性的影响 柠檬苦素溶液与1 mg/mL的明胶溶液以1∶1 (v/v)的比例混合均匀,置于室温下避光孵育0、0.5、1.0、6.0、12.0 h后按照“1.2.4.1”测定抑菌圈直径。

1.2.4.5 Fe3+和Fe2+对柠檬苦素抑制根霉活性的影响 柠檬苦素溶液分别与10 mmol/L的FeCl3、FeSO4溶液以9∶1 (v/v)的比例混合均匀,室温下避光孵育0、0.5、1.0、6.0、12.0 h后按照“1.2.4.1”测定抑菌圈直径。

1.2.5 柠檬苦素抑制根霉的机理

1.2.5.1 柠檬苦素对根霉菌丝体总糖的影响 采用蒽酮比色法[15]。移取5 mL PDB培养液与0.1 mL根霉孢子悬浮液至离心管,28 ℃下150 r/min振荡培养5 d后,分别加入等量不同浓度(0、312.5、625、1250、2500、5000 μg/mg)的柠檬苦素溶液。以加入等量的15%乙醇作为对照。混合液振荡培养3 d后过滤得根霉菌丝,用蒸馏水冲洗菌丝数遍后用滤纸吸干。称取0.05 g菌丝,加入蒸馏水研磨至糊状后加水至5 mL,沸水浴15 min后快速冷却至室温。用蒸馏水定容至25 mL,加入0.25 mL 10%醋酸铅溶液,充分摇匀,以沉淀其中的蛋白质。反应完全后,加入0.05 g草酸以除去过量的醋酸铅溶液,充分摇匀,反应完全后过滤。分别取滤液2 mL,加入0.5 mL蒽酮试剂和5 mL浓H2SO4,摇匀后密封置于沸水浴加热5 min后,快速冷却至室温,静置片刻,于620 nm波长下测定OD值。每个处理重复 3 次。根据已得葡萄糖标准曲线(y=0.009x+0.0031,R2=0.9979)得到含糖量A。

式中:A为在标准曲线上查得的含糖量,μg;V为总体积,mL;Vs为测定取样体积,mL;W为样品质量,g。

1.2.5.2 柠檬苦素对根霉胞外可溶性蛋白含量的影响 采用考马斯亮蓝G-250比色法[16]。制得标准曲线:y=0.0058x-0.0135,R2=0.9931。将根霉孢子悬液接种于PDB培养基,加入柠檬苦素使其最终浓度为MIC后,置于28 ℃恒温培养,分别于0、8、16、24、32、40 h移取孢子悬浮液,1000 r/min离心10 min后,取0.1 mL上清液、5 mL考马斯亮蓝G-250试剂和0.9 mL蒸馏水,充分混匀,放置5 min后,在595 nm波长下测定其OD值。以加入15%乙醇为对照。根据所测样液的OD值,通过标准曲线计算蛋白质含量。

1.2.5.3 根霉菌液碱性磷酸酶(AKP)活力的测定 采用比色法[17]。调整浓度为106个/mL的根霉孢子悬浮液中的柠檬苦素最终浓度为1×MIC。将混合液于28 ℃,150 r/min振荡孵育0、2、4、6、8、10 h后,1000 r/min离心10 min,取上清液按照碱性磷酸酶(AKP)试剂盒方法测定其AKP活力。以15%乙醇作为对照。

1.2.5.4 扫描电镜分析 取100 μL 106个/mL的根霉孢子悬浮液涂布在PDA平板培养基上,28 ℃恒温培养48 h后,用打孔器制得直径为4 mm的菌饼,将菌饼倒置在含有2×MIC浓度柠檬苦素的PDA培养基上,28 ℃培养48h。用无菌的镊子将平板上的菌丝刮下,放入装有2.5%戊二醛固定液的离心管内,在4 ℃下固定13 h。用pH为5.6的磷酸盐缓冲液冲洗5 min,共洗2次,以去除孢子中的戊二醛。在4 ℃、12000 r/min条件下离心10 min,除去上清液,加入0.5 mL无菌水摇晃至孢子悬浮。取一滴于洁净的盖玻片上,经空气干燥后,喷金镜检[18]。以15%乙醇为对照。

1.3 数据处理

每个测定均重复三次,结果表示为平均值±标准偏差。应用SPSS 22.0软件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)中的One-Way ANOVA对所有数据进行方差分析,利用邓肯式多重比较对差异显著性进行分析。

2 结果与分析

2.1 柠檬苦素抑制根霉的活性

2.1.1 柠檬苦素对根霉的MIC和MBC 由表1可知,柠檬苦素对根霉的MIC为1250 μg/mL,MBC为5000 μg/mL。

表1 柠檬苦素对根霉的MIC和MBCTable 1 MIC and MBC of limonoids against Rhizopus

2.1.2 柠檬苦素对根霉孢子萌发和菌丝生长抑制率的影响 由表2可知,柠檬苦素抑制根霉孢子萌发的EC50值约为菌丝生长的EC50值的53.79%。由图1可知,柠檬苦素质量浓度为312.5 μg/mL时,对根霉孢子萌发的抑制率开始快速提高;而对菌丝生长抑制率在浓度高于625 μg/mL时开始快速提高。柠檬苦素质量浓度为156.25～1250 μg/mL时,孢子萌发抑制率的提升速率较快;在柠檬苦素质量浓度为1250～2500 μg/mL时,菌丝生长抑制率的增长趋势大于孢子萌发抑制率。但相同浓度柠檬苦素对根霉孢子萌发抑制率始终大于菌丝生长抑制率。因此,相同质量浓度柠檬苦素对根霉孢子萌发具有更强的抑制作用,高浓度柠檬苦素对根霉菌丝才有较好的抑制作用。

表2 柠檬苦素对根霉的毒力回归方程和EC50Table 2 Virulence regression equation and EC50 of limonoids against Rhizopus

图1 柠檬苦素对根霉的菌丝和孢子萌发的抑制率

2.2 不同因素对柠檬苦素抑制根霉活性的影响

由图2A、图2C可知,经过不同温度和添加明胶的处理后,柠檬苦素对根霉的抑菌活性没有显著变化(p>0.05)。由图2B可知,pH为4和6时,柠檬苦素对根霉的抑菌活性最强;随着pH升高或降低,抑菌活性逐渐显著减弱(p<0.05)。这与薤白乙醇提取物的抑菌活性受pH影响的研究结果一致[18]。可能是因为柠檬苦素溶液pH接近4,环境的酸碱性改变会造成其变性,从而抑菌活性降低;而根霉受强酸和强碱环境影响较小,从而导致抑菌圈直径变小。同时,由图2D可知,Fe3+、Fe2+均能显著增强柠檬苦素的抑菌活性(p<0.05),且随处理时间延长,增强作用比较稳定。

图2 不同因素对柠檬苦素抑制根霉活性的影响

2.3 柠檬苦素抑制根霉的机理

2.3.1 柠檬苦素对根霉菌丝总糖含量的影响 由图3可知,对照菌丝体总糖含量为0.12%,经质量浓度为312.5 μg/mL的柠檬苦素处理后,根霉菌丝体总糖含量为0.11%,是对照菌丝体总糖含量的87.53%。随着处理柠檬苦素溶液浓度的提高,菌丝体总糖含量降低。当柠檬苦素质量浓度为5000 μg/mL时,菌丝体总糖含量仅为0.04%,为对照菌丝体总糖含量的32.66%。经Duncan方差分析,随柠檬苦素处理浓度的增大,根霉菌丝体总糖含量呈现显著下降的趋势(p<0.05)。说明经柠檬苦素处理后,根霉菌丝体内糖外渗,且随柠檬苦素浓度增高,外渗量增大,菌丝体总糖含量越低。

图3 柠檬苦素浓度对根霉菌丝总糖含量的影响

2.3.2 柠檬苦素对根霉胞外可溶性蛋白含量的影响 由图4可知,柠檬苦素处理组和对照组的胞外蛋白质含量均呈上升,并逐渐稳定的趋势,但处理组胞外蛋白质含量上升幅度远远大于对照组。说明15%乙醇和柠檬苦素均会导致根霉胞内蛋白质渗出,但柠檬苦素的作用明显更强。同时可知,处理组胞外蛋白质含量在作用初期开始迅速上升,处理时间为16 h时,胞外蛋白质含量达到最高值,并小幅下降,趋于稳定。说明柠檬苦素迅速影响了根霉细胞膜的通透性,处理时间为16 h时,胞内蛋白质渗出已达最高值;且质量浓度为625 μg/mL(MIC)的柠檬苦素对根霉的作用是抑制,并非杀灭[19],根霉可以利用胞外蛋白质进行一定的生长代谢,因此,胞外蛋白质含量会出现小幅波动。

图4 柠檬苦素对根霉胞外蛋白质含量的影响

2.3.3 柠檬苦素对根霉菌液AKP活力的影响 碱性磷酸酶(AKP)是一种存在与细胞壁与细胞膜之间的酶,当细胞壁遭受破坏时,AKP泄露,因此通过检测细胞外AKP活力即可反映出细胞壁完整性[20]。由图5可知,柠檬苦素处理组AKP活力从处理初期开始呈持续上升趋势,在8 h后趋于稳定,且AKP活力远远大于对照组。说明柠檬苦素可以使根霉细胞壁的通透性发生了变化,导致根霉内AKP大量渗出;且8 h后柠檬苦素对根霉细胞壁破坏作用已基本完成。

图5 柠檬苦素对根霉菌液AKP活力的影响

2.4 电镜分析

由图6可知,在柠檬苦素作用后,根霉形态与对照组相比发生了明显变化。对照组根霉的孢子(图6A1和图6B1)表面完整、光滑,形态较饱满;菌丝(图6C1)粗壮、表面光滑,无断裂。2×MIC浓度柠檬苦素处理后的根霉孢子(图6A2和图6B2)凹陷严重,溶出物明显,出现严重皱缩现象;菌丝(图6C2)出现断裂扭曲、变形、变细。与对细胞壁、细胞膜破坏性以及对孢子、菌丝的抑制作用研究结果一致。

图6 根霉扫描电镜图

3 结论

柠檬苦素对根霉的MIC和MBC分别为1250和5000 μg/mL;相同浓度下,孢子萌发抑制率大于菌丝生长抑制率。柠檬苦素对根霉的抑菌活性不受加热和明胶的影响,在弱酸性环境较强,且Fe3+、Fe2+均能提高柠檬苦素的抑菌活性。因此,柠檬苦素比较适合在弱酸性的环境中应用,并且可以应用于富含Fe3+、Fe2+和蛋白质,需要经过高温处理的食品中作为根霉的抑菌剂。进一步对柠檬苦素抑菌机理的研究发现,柠檬苦素可以使根霉胞内物质大量渗出。随着处理浓度增加,渗出量增大。且处理前期,处理时间越长,胞内物质渗出量越大;但到8和16 h时,AKP和蛋白质渗出量基本趋于稳定。通过扫描电镜观察发现经柠檬苦素处理的根霉孢子出现变形,溶出物渗出明显;菌丝发生细微断裂扭曲、变形、变细。因此,柠檬苦素可以使根霉细胞变形、破裂,通过改变根霉细胞壁和细胞膜的通透性,使胞内物质渗出,从而抑制根霉的生长。