付子豪，王 臻，吴 洁，杨红燕，张 星，高 峰，李 嘉

(空军军医大学航空航天医学系，陕西 西安 710032)

大鼠后肢去负荷(hindlimb unloading)作为地面研究模拟失重(weightlessness simulation)的动物模型已被学术领域广泛接受和认可[1]。目前已有的大鼠后肢去负荷方法包括尾部悬吊(tail suspension)，背部悬吊(back harness suspension)和骨盆悬吊(pelvic suspension)[2]等。尾部悬吊由于实验动物应激小的优点逐渐为国内外实验室所采用[3-5]。目前模拟失重模型的制备方法主要参考Morey-Holton等[1]和陈杰等[6]进行整理和改进的经典方法，该方法通过使用纵向牵引胶带(traction tape)粘贴大鼠尾部，横向固定胶带(filament tape)缠绕，外层用纱布包裹固定使尾套与大鼠尾部紧密贴合，可实现长达120 d的长期尾吊。但是该方法要求操作者在包裹鼠尾和悬吊大鼠后肢方面具有较丰富的经验，能够较好把握横向固定胶带和外层纱布包裹的松紧程度，因为包裹过紧容易影响大鼠尾部血液供给导致远端缺血、畸形和坏死；包裹过松易导致大鼠尾部与尾套粘合不牢，从而脱落滑出。本研究旨在改进尾套制作及包裹固定的方法，以制备简单易行、成功率高的大鼠模拟失重模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD雄性大鼠90只，体质量260～280 g，来源于空军军医大学实验动物中心，许可证号：SCXK(军)2012-0005。本实验遵照空军军医大学实验动物饲养和使用规定进行，符合伦理要求。

1.2 试剂与仪器

安息香(美国Sigma-Aldrich公司,货号V900584)；松香；无水乙醇；医用棉布基胶带；纱布；塑料小管；鱼线转环；聚乙烯发泡棉网套；帆布套；大鼠尾部悬吊笼。

1.3 动物分组

90只SD大鼠随机分为3组：经典尾吊组，改良尾吊组和对照组，每组30只。

1.4 模型大鼠尾部处理

轻柔抓取待悬吊大鼠，使其钻入帆布套内限动，仅露出尾部(图1A)，黑暗安静的环境有助于减小应激，方便操作。用肥皂水(或酒精)仔细清洗去除尾部皮肤表面污垢，吹风机吹干。无水乙醇分别溶解安息香及松香至饱和状态。用棉签蘸取适量安息香酊，均匀涂抹尾部粘贴区(从根部起始至少覆盖尾部表面积三分之二)，吹干后重复该步骤两次，使得粘贴区均匀覆盖安息香以增加皮肤表面涩度，安息香也可起到防腐止痛作用。按照同样操作方法涂抹松香酊并吹干，重复2次，松香可增加尾部皮肤表面的黏性(图1)。

1.5 模型大鼠尾套制作

剪取大约两倍于粘贴区长度的胶带作为纵向牵引胶带，中点处放置与胶带条等宽塑料小管。将牵引胶带沿尾根部开始粘贴，覆盖粘贴区后绕过小管粘贴于对侧尾部表面，轻轻按压贴紧。胶带的宽度根据大鼠尾根部的粗细程度选择，保证鼠尾两侧牵引胶带之间无重叠。剪取3或4条短胶带按照均匀间隔以C字形缠绕牵引胶带(图1B)。改良尾吊组大鼠用聚乙烯发泡棉网套包裹鼠尾。聚乙烯发泡棉网套的长度应与牵引胶带覆盖区域一致，宽度接近于鼠尾尾根处周长，各网格边长约为1 cm。尾套外层用宽约3～4 cm，长约25 cm的纱布将聚乙烯发泡棉网套和鼠尾一同裹紧固定。经典尾吊组大鼠无聚乙烯发泡棉网套层，只用纱布包裹。塑料小管内穿入曲别针并与鱼线转环相连，鱼线转环可以360°旋转使大鼠利用前肢活动时方向不受限制(图1C)。对照组大鼠尾部不做特殊处理。

1.6 模型大鼠尾部悬吊方法

将尾套制作好的大鼠从帆布套中取出放入尾部悬吊笼内，每笼1只。将鱼线转环与吊臂上的滑轮相连，调节吊臂高度使大鼠后肢悬空去负荷，保证后肢完全伸直时无法触及鼠笼底面即可。大鼠始终处于头低位状态，躯干与鼠笼底面形成大约30°角。随着大鼠生长发育，后肢长度增加将接触鼠笼底面恢复承重，操作者需要每5 d左右提升一次吊臂高度维持后肢去负荷。每日观察大鼠整体健康状况是否良好，尾套是否脱落。自由进食、饮水，(23±2)℃环境温度，12 h/12 h光/暗交替循环条件下饲养。对照组饲养在相同悬吊笼内，各项条件与悬吊组保持一致(图2)。尾吊时间为4周，实验结束后观察大鼠尾部损伤和尾套脱落情况，测量大鼠体质量及右侧比目鱼肌湿重。尾吊模型构建成功的标准为比目鱼肌湿重及占体质量比显著降低，体质量增加且与对照组无显著差别，尾部无缺血坏死等严重损伤，尾套贴合紧密未脱落，完全符合以上四项指标评估为模型构建成功。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠体质量、比目鱼肌湿重及比目鱼肌湿重占体质量比值

尾吊结束后，对照组、经典尾吊组和改进尾吊组大鼠体质量较尾吊前均显著增加(P<0.01)，三组之间最终体质量无显著差异(P>0.05)。但经典尾吊组和改良尾吊组的比目鱼肌湿重较对照组均显著降低(P<0.01)，比目鱼肌湿重占体质量比值较对照组均显著减小(P<0.01，表1)。

Tab. 1 Body weight and right soleus wet weight of rats in three different n=30)

**P<0.01vsthe control group;##P<0.01vsbaseline in the same group

2.2 尾部并发症发生率及模型成功率

操作者每日密切观察大鼠整体健康状况。大鼠可利用前肢自由活动、饮食和进水，精神状态良好。但随着大鼠不断生长，尾部直径增加，部分经典尾吊组大鼠由于尾套包裹过紧出现尾部远端缺血坏死情况，尾部缺血坏死的发生率为40.0%。尾套包裹过松使得尾套脱落的发生率为26.7%，模型成功率为33.3%。与经典尾吊组相比，改良尾吊组的尾部损伤程度明显降低(图3)，远端缺血坏死率为13.3%(P<0.05),尾套脱落率为3.3%(P<0.05)，而模型成功率提高至83.3%(P<0.01，表2)。无模型同时出现尾部缺血坏死和尾套脱落两种并发症。

Tab. 2 The incidence of rat tail complications and success rates of models between the two groups(n=30)

#P<0.05，##P<0.01vsthe classical suspension group

3 讨论

在长期失重环境中，重力缺失将引起机体生理功能的显著变化，对肌肉骨骼、心血管、免疫、泌尿，神经系统和内分泌代谢等多系统产生不同影响[7]。构建地面模拟失重模型对于阐明空间失重环境改变机体生理功能的机制，从而进一步研究对抗措施，预防或逆转可能潜在的严重损害具有重要意义[8,9]。地面模拟失重模型相较于直接在空间环境进行失重实验有许多优势：(1)实验周期的设计不需要考虑空间飞行任务和机组成员的时间安排；(2)太空飞行对舱内环境要求苛刻，许多实验操作无法在太空舱内进行；(3)可实现以较小的代价及时调整实验方案和多次重复实验；(4)动物模型可在实验过程中随时麻醉取材等[1]。

大鼠是地面模拟失重模型最常用的动物[10]。上世纪80年代，Morey-Holton等[7,11]构建了大鼠尾部悬吊法使后肢去负荷，体液头向转移，模拟航天员在太空时机体发生的改变。与躯干整体悬吊相比，尾部悬吊大鼠血浆皮质酮水平较低，体质量无明显减轻，应激程度小[12,13]。尾部悬吊逐渐成为目前最主要的制备大鼠模拟失重的方法。其操作步骤经过许多改进，陈杰等[6]完善的尾吊方法实现了长期尾吊，减轻了尾部损伤，引用次数超过300余次；Morey-Holton等[1]总结的详细模型制备技术引用次数超过500余次；Marjolein等[14]用注射器针筒包绕尾套能够防止大鼠撕咬牵引胶带等。

构建尾部悬吊模型关键步骤是制作包裹鼠尾的尾套。目前经典尾部悬吊方法存在薄弱点，即要求操作者有较为丰富的尾套制作经验，能够控制好外层纱布包裹固定鼠尾的松紧程度。否则在进行尾吊实验特别是4周以上的长期尾吊时，大鼠尾部易出现如缺血坏死或尾套脱落等并发症，造成模型构建失败，例如尾部缺血坏死，甚至感染坏疽对大鼠体内免疫、代谢等功能产生不良影响，对实验结果产生干扰。模型构建成功率较低也会增加模型制备的整体工作量。针对该薄弱环节本研究进行简便易行的改进，创新性地在C字形横向固定胶带和纱布之间增加一层聚乙烯发泡棉网套。该网套材质柔软，弹性和延展性较好，既保持牵引胶带对鼠尾的紧密贴合防止尾部脱落，又形成缓冲避免对鼠尾硬性挤压从而保证远端血液循环。聚乙烯发泡棉在生活中易于获得(常用于食品包装)，网套制作快捷简便。改进的尾吊模型制备方法优越性在于降低了对实验者尾套制作经验的要求，整体减少了工作时间，提高了模型制备成功率，实用性强。本研究还发现，牵引胶带应具有较高的强度，否则大鼠体质量不断增加易使胶带断裂。故不建议使用目前常见的纸基透气医用胶带，而换用黏性和强度更高的棉布基胶带。

除尾套制作方法外，大鼠模拟失重模型还有其他值得探讨改良之处。例如，目前大鼠的尾吊角度即大鼠躯干与水平面所形成的夹角大多为30°，该角度下大鼠前肢承重约为自身体质量的一半，与非尾吊大鼠相似。该角度使大鼠的腰椎去负荷而颈椎保持正常状态，体液头向转移[1,15]。孙联文等[16]研究发现，非尾吊大鼠在站立状态和休息状态等不同的姿态下，前肢承重也不相同。要使尾吊大鼠前肢承担与正常站立状态时的44.6%相同,其尾吊角度根据公式经计算后应为35°；而要与休息时正常大鼠的前肢承重相当,尾吊角度达63°左右。此外，正常大鼠约有40%的时间前肢几乎不承重。如果从大鼠前肢承重考虑,30°尾吊角度则偏小。如何根据实际研究内容，结合不同系统(运动、循环、免疫等)不同部位(前肢、后肢)之间差别，从而合理调整大鼠尾部悬吊角度，改良大鼠模拟失重模型制备的其他环节，需要更进一步的研究。